不同加工形式茶葉茶多酚含量及抗氧化活性比較研究

王萬方，張懷令，陳 麗 ，史彩艷，肖 懷*

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南西力生物技術(shù)有限公司，昆明 650204）

茶（Camellia sinensis Kuntze）在我國(guó)有著悠久的飲用歷史，茶中含有大量的酚類物質(zhì)不僅能夠保護(hù)體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，而且還可以促進(jìn)其活性，從而保護(hù)細(xì)胞膜中的脂質(zhì)過氧化〔1〕。目前研究證明茶葉提取物具有抗癌、抗衰老、抗輻射、清除人體自由基、降低血糖血脂等重要的藥理功能，其主要功能性成分是茶多酚（Tea-polyphenols，簡(jiǎn)稱TP），是茶葉主要抗氧化物質(zhì)，約占茶葉干重的18%～36%〔2〕。由于產(chǎn)地、采摘季節(jié)及采摘要求，加工方式等的不同，茶葉的種類不下千種。從大類上可以分為白茶、綠茶、黃茶、紅茶、黑茶等。本文以普洱綠茶、普洱黃茶、普洱蒸酶茶、普洱黑茶、普洱紅茶、大栗樹碧螺春、大栗樹磨鍋茶等不同品種及不同加工方式的茶葉為原料，對(duì)其中的茶多酚含量及抗氧化活性進(jìn)行比較研究。茶多酚含量采用福林酚比色法進(jìn)行測(cè)定，多酚類物質(zhì)可以被福林酚試劑中的鎢鉬酸定量氧化，鎢鉬酸自身被還原（使W6+變?yōu)閃5+），生成藍(lán)色化合物，顏色的深淺跟茶多酚含量呈正相關(guān)〔3〕。鐵還原力的測(cè)定通常用來評(píng)價(jià)天然抗氧化劑的供電子能力，提取物中的抗氧化成分將Fe3+還原成Fe2+，使溶液顏色發(fā)生變化。顏色變化的程度取決于溶液組分的還原力，吸光度值越大，表明還原能力越強(qiáng)〔4〕。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料 7種不同品牌及加工形式的茶葉（普洱綠茶、普洱黃茶、普洱蒸酶茶、普洱黑茶、普洱紅茶、大栗樹碧螺春、大栗樹磨鍋茶）均購自大理泰興市場(chǎng)云南綠茶總經(jīng)銷店，均為普通散茶，商家未提供廠家及批號(hào)。

原料于45.5℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，粉碎，過50目篩，保存于干燥器中備用。

1.1.2 試劑 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，No.20130812）；95%乙醇；10%福林酚試劑；7.5%碳酸鈉溶液；磷酸緩沖液（0.2 mol/L pH 6.6）；0.2 mol/L磷酸二氫鈉（≥99.0%）；0.2 mol/L磷酸氫二鈉（≥98.0%）；1%鐵氰化鉀；10%三氯乙酸（≥99.0%）；0.1%三氯化鐵；鎢酸鈉（Na2WO2·2H2O）；鉬酸鈉（≥99.0%）；去離子水；85%的磷酸；濃鹽酸；硫酸鋰（Li2SO4）。除標(biāo)準(zhǔn)品外，其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 T6型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科技有限公司）；SSY型電熱恒溫水浴鍋（北京泰克儀器有限公司）；FA2004N電子天平；SY3200-T型超聲波清洗器（上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DX-208型低溫冷卻液循環(huán)泵（北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及方法考察

1.2.1 樣品溶液的制備 精密稱取3份茶葉粉末1.0 g于100 mL圓底燒瓶中，加20 mL 95%的乙醇超聲提取30 min，過濾，濾渣繼續(xù)以95%乙醇提取2次，每次15 mL，合并提取液，用95%乙醇定容至50 mL得茶多酚總提取液，冷藏備用。精密量取總提取液1 mL于50 mL容量瓶中用超純水定容，搖勻，得樣品溶液。

1.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取沒食子酸對(duì)照品50 mg于50 mL容量瓶中用超純水定容，搖勻，得濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密移取儲(chǔ)備液 0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于50 mL容量瓶中，向各容量瓶中加入1 mL 95%乙醇，用超純水定容，搖勻，即得。

1.2.3 吸光度測(cè)定 精密移取“1.2.1”或“1.2.2”項(xiàng)下配制的溶液1 mL于25 mL三角瓶中，分別加入10%的福林酚試劑5.0 mL，搖勻。反應(yīng)3～8 min，加入7.5%的碳酸鈉溶液4 mL，搖勻，室溫放置1 h。以“1.2.2”項(xiàng)中第一份溶液加入相應(yīng)顯色劑為空白對(duì)照，于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值〔5〕。

1.2.4 顯色時(shí)間考察 樣品溶液按“1.2.3”項(xiàng)操作至加入全部顯色劑，搖勻。從10 min開始測(cè)定其吸光度，每10 min測(cè)定1次至120 min。結(jié)果顯示加入顯色劑后，樣品吸光度值在不斷增加，開始的30 min內(nèi)變化較大，30 min以后，每10 min的增加值較低，并基本為一恒定常數(shù)，故顯色時(shí)間定為30 min。

1.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“1.2.2”項(xiàng)下各溶液1 mL，按“1.2.3”處理，以沒食子酸的濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度為（A）縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程A=0.1061C+0.0675（r=0.9998）。結(jié)果表明沒食子酸在1.110～11.10 μg/mL之間呈良好的線性關(guān)系。

1.2.6 精密度試驗(yàn) 精密移取5份“1.2.2”項(xiàng)下濃度為0.0222 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按“1.2.3”項(xiàng)操作，測(cè)得吸光度分別為 0.2993、0.2983、0.3023、0.3063、0.3123，RSD為1.89%，結(jié)果表明儀器的精密度良好〔6〕。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6份普洱綠茶粉末1.0 g，按“1.2.1”、和“1.2.3”項(xiàng)操作，測(cè)得吸光度值并帶入回歸方程后的茶多酚含量分別為：182.46、181.35、185.15、176.53、179.34、181.53 mg/g，RSD為1.61%。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取普洱綠茶粉末1.0 g，按“1.2.1”項(xiàng)操作得樣品溶液，分別于1、2、4、8、12、24 h密移取1 mL樣品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)操作，測(cè)得吸光度分別為 0.8300、0.8523、0.8593、0.8647、0.8717、0.8747，RSD為1.90%，表明提取物溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取9份茶多酚含量為180.97 mg/g的普洱綠茶粉末0.5 g，分別準(zhǔn)確加入沒食子酸對(duì)照品 70、100、140 mg，按“1.2.1”、“1.2.3”項(xiàng)操作并帶入回歸方程計(jì)算。結(jié)果表明平均加樣回收率為101.1%，RSD為2.05%。見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

1.2.10 茶多酚含量測(cè)定 參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)〔5〕GB/T8313-2008中的方法，精密量取“1.2.1”項(xiàng)的溶液1 mL，按照“1.2.3”項(xiàng)操作，按下式計(jì)算茶多酚含量（單位mg/g）。

式中：A為樣品測(cè)試液吸光度；b為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距：V為樣品提取液體積，50 mL；d為稀釋因子，500；K為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；m為樣品質(zhì)量，單位為g。

1.2.11 抗氧化活性測(cè)定 抗氧化活性以樣品還原Fe3+的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用Oyaizu（1986）的方法進(jìn)行測(cè)定〔7〕。精密量取“1.2.1”項(xiàng)溶液及“1.2.2”項(xiàng)下第一份溶液1 mL于刻度試管中，加入0.2 mol/L（pH 6.6）的磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，在50℃保溫20 min后迅速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液1 mL，充分混合后加入U(xiǎn)P級(jí)超純水2.5 mL和0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL，以“1.2.2”項(xiàng)下第一份溶液為空白，在700 nm處測(cè)定吸光度。抗氧化活性以單位質(zhì)量樣品吸光度值表示，吸光度值越大，則樣品的抗氧化活性越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶葉中茶多酚含量比較 精密稱取每種品種茶葉1.0 g，進(jìn)行茶多酚含量測(cè)定。見表2。從表2可以看出，不同加工形式的茶中茶多酚含量差異顯著，而在同類茶葉中含量差異較小。

表2 不同茶葉中茶多酚含量 （±s,mg/g,n=3）

表2 不同茶葉中茶多酚含量 （±s,mg/g,n=3）

注：*量取“1.2.1”項(xiàng)的溶液體積為5 mL，定容至25 mL。

茶葉品種普洱綠茶普洱黃茶普洱蒸酶茶大栗樹碧螺春大栗樹磨鍋茶*普洱黑茶*普洱紅茶■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■取樣量/g 1.01061.06881.02441.25211.20411.07881.16131.29181.02361.00371.10081.22051.19841.03591.14551.03851.12081.19601.23881.01891.1904吸光度A 0.84530.88100.85671.00930.99670.88030.92001.03370.87330.81200.81100.87570.80270.72300.80770.82370.99471.02831.06770.70870.7503茶多酚含量/(mg/g)180.74±1.21178.86±2.58178.23±6.49163.32±10.05148.64±3.8718.53±1.2215.79±2.88

2.2 不同茶葉抗氧化活性比較 每種品種茶葉各提取3份測(cè)定其鐵還原能力。見表3。從表2和表3可知，發(fā)酵茶和未發(fā)酵茶提取物鐵還原能力差異顯著，并與其中茶多酚含量呈正相關(guān)。

表3 不同加工形式茶葉的還原能力比較（xˉ± s,A/g,n=3）

茶多酚的還原作用很強(qiáng)，有很好的抗氧化功效，是茶葉中主要抗氧化成分。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，茶葉中茶多酚含量與自由基的清除能力呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，也證實(shí)了茶多酚類物質(zhì)為茶葉中的主要抗氧化活性物質(zhì)。

3 討論

茶葉的傳統(tǒng)加工主要有發(fā)酵及未發(fā)酵2種。試驗(yàn)中普洱黑茶和普洱紅茶為發(fā)酵茶，普洱黃茶為輕微發(fā)酵茶，其他幾種均為綠茶。發(fā)酵過程中、在茶葉自身氧化酶及微生物的作用下，茶葉中的多酚類經(jīng)羥基的氧化、偶聯(lián)作用，生成苯醌類如茶黃素（theaflavins）、茶紅素（thearubingins）等物質(zhì)，茶多酚含量相應(yīng)降低〔8〕。試驗(yàn)結(jié)果表明未經(jīng)發(fā)酵及輕微發(fā)酵的綠茶和黃茶，茶多酚含量差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)〔9〕報(bào)道的茶葉中茶多酚含量基本相當(dāng)，而發(fā)酵后的紅茶和黑茶，茶多酚只保留了未經(jīng)發(fā)酵及輕微發(fā)酵的約10%。

發(fā)酵可以增加或改變茶葉的醇香、口感甚至功效，但發(fā)酵過程也是使茶多酚類物質(zhì)大大降低、抗氧化活性顯著減小的過程。消費(fèi)者在選擇茶葉時(shí)，除了依據(jù)個(gè)人的喜好，還應(yīng)根據(jù)自身身體狀況及需要，選取適合自己的茶葉品種，充分利用和發(fā)揮茶葉的各種功效。

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