SATB1在甲狀腺癌中的表達(dá)及促進(jìn)甲狀腺癌侵襲能力的實(shí)驗(yàn)研究

萬(wàn)里,鄭旭琴

(1.湖北省武漢市第三醫(yī)院光谷院區(qū) 普外科,湖北 武漢 430073;2.南京醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系,江蘇 南京 210029)

SATB1在甲狀腺癌中的表達(dá)及促進(jìn)甲狀腺癌侵襲能力的實(shí)驗(yàn)研究

萬(wàn)里1,鄭旭琴2

(1.湖北省武漢市第三醫(yī)院光谷院區(qū) 普外科,湖北 武漢 430073;2.南京醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系,江蘇 南京 210029)

目的 研究富含AT序列的特異結(jié)合蛋白1（special AT rich sequence binding protein 1，SATB1)對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，探討SATB1促進(jìn)甲狀腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。方法 構(gòu)建針對(duì)SATB1基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染甲狀腺癌SW-579細(xì)胞，qRT-PCR和Western blotting方法測(cè)定轉(zhuǎn)染效率及上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-鈣粘素（E-cadherin)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白波形蛋白（vimentin)的表達(dá)變化；qRT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Twist1和Snail1，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9，以及炎性因子IL-6和IL-8的表達(dá)變化；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變；細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)SATB1后甲狀腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力變化。Western blotting檢測(cè)SATB1增強(qiáng)表達(dá)后Akt磷酸化表達(dá)變化，PI3K/Akt通路抑制劑LY294002處理細(xì)胞后觀察過(guò)表達(dá)SATB1的SW579細(xì)胞遷移侵襲能力變化。結(jié)果 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SATB1后每個(gè)視野下遷移細(xì)胞數(shù)（196±10)個(gè)，較對(duì)照組（107±12)個(gè)明顯增加（P＜0.01)；侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SATB1后穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)（158±12)個(gè)，較對(duì)照組（86±15)個(gè)明顯增加（P＜0.01)。Western blotting結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染SATB1后，在總Akt蛋白無(wú)改變的情況下，SW-579細(xì)胞磷酸化Akt（p-Akt)明顯增加。而通過(guò)加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯減弱。結(jié)論 SATB1與甲狀腺癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)；其高表達(dá)具有促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)的作用；PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與了SATB1的促轉(zhuǎn)移過(guò)程。

甲狀腺癌；SATB1；轉(zhuǎn)移；PI3K/Akt

隨著對(duì)SATB1研究的深入,研究者發(fā)現(xiàn)SATB1不僅調(diào)節(jié)眾多與腫瘤相關(guān)的基因,而且參與調(diào)節(jié)多條與腫瘤生長(zhǎng)、分化及轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要分子通路［1-2］。儼然成了腫瘤細(xì)胞交通的重要信號(hào)燈。然而,生物體不同的器官、組織乃至不同的細(xì)胞間,分子基因的表達(dá)及信號(hào)通路可能存在差異［3］。SATB1在甲狀腺癌中的作用及相關(guān)機(jī)制目前未有研究報(bào)道。本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染SATB1的SW-579細(xì)胞及空載體細(xì)胞中PI3K/Akt通路重要的信號(hào)分子Akt磷酸化程度的改變,研究此通路的活化程度。同時(shí)通過(guò)加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002觀察SW-579細(xì)胞遷移侵襲能力的改變以及與轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要分子的變化。探討SATB1調(diào)節(jié)甲狀腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,以補(bǔ)充對(duì)SATB1在甲狀腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 轉(zhuǎn)染了人SATB1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的SW-579細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了空載體的SW-579細(xì)胞用15%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞置于與5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天傳代一次。在做LY294002抑制實(shí)驗(yàn)時(shí),將相同數(shù)量的細(xì)胞種于6孔板中,提前1天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理。

1.2 LY294002抑制實(shí)驗(yàn) 相同數(shù)量的轉(zhuǎn)染SATB1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的SW-597細(xì)胞分別種于2個(gè)6孔板中,實(shí)驗(yàn)前12 h將培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓處理,以降低細(xì)胞增殖的影響。查閱文獻(xiàn)后［2］,1孔細(xì)胞以10 umol/L濃度的LY294002處理,另1孔細(xì)胞加入相同體積的PBS。12h后棄去培養(yǎng)基,消化細(xì)胞后制成細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3 Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-Akt與Akt 提取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,滴管吸棄培養(yǎng)液,PBS沖洗3次,甩干液體后加400 uL的含PMSF的RIPA裂解液,冰上裂解30min,期間注意多次反復(fù)吹打,細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后用移液器將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)。4℃12000 g離心15min。移液器小心吸取上清液,取一部分按下面的步驟測(cè)蛋白濃度,剩下的蛋白與2×SDS加樣緩沖液按1∶1體積混合,放入1.5 mL EP管中在水浴鍋內(nèi)100℃煮10 min,于冰上冷卻后分裝,-80℃保存。用分光光度計(jì)測(cè)蛋白濃度;用自來(lái)水沖洗干凈制膠玻璃板后放于烤箱烤干后按要求安裝,為了避免漏膠,配制封底膠。將凝膠垂直置于室溫下20min。取出變性的蛋白質(zhì)樣本,上樣量為30 ug,在加樣孔的外周孔加1×SDS凝膠加樣緩沖液以平衡。將電泳裝置接通電源,設(shè)置電源加壓量為60 V,當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑前沿進(jìn)入分離膠后,電壓可提高到90～120 V,繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠底部(約2.5 h),關(guān)閉電源。

2 結(jié)果

2.1 SATB1在甲狀腺癌細(xì)胞EMT中的作用

2.1.1 SATB1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率測(cè)定:SATB1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW-579細(xì)胞篩選培養(yǎng)后,收獲細(xì)胞,提取RNA及蛋白后,qRTPCR方法和Western blotting方法檢測(cè)SATB1在RNA及蛋白水平上轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染SATB1后,過(guò)表達(dá)細(xì)胞較空載體對(duì)照組SATB1 RNA及蛋白水平表達(dá)均明顯增加,其中RNA水平增加55倍(P＜0.001)。證實(shí)轉(zhuǎn)染有效。

2.1.2 過(guò)表達(dá)SATB1對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞形態(tài)的影響:在普通倒置顯微鏡下觀測(cè)轉(zhuǎn)染SATB1基因后SW-579細(xì)胞形態(tài)改變,可見(jiàn)上皮樣的SW-579細(xì)胞由連接緊密的類圓形變成連接松散的狹長(zhǎng)形,細(xì)胞間連接減少(見(jiàn)圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)染SATB1后,SW-597細(xì)胞形態(tài)改變Fig.1 SW-597 cellmorphological change after transfection SATB1

2.1.3 過(guò)表達(dá)SATB1對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞標(biāo)志分子的影響:上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要分子,通過(guò) qRT-PCR檢測(cè)到過(guò)表達(dá) SATB1后,E-cadherin表達(dá)減少(71.20±0.65)%(P＜0.05),Vimentin表達(dá)增加(4.30±0.73)倍(P＜0.05),Western blotting結(jié)果與之一致。同時(shí),與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail1、Twist1分別增加(3.90±0.21)、(2.30±0.18)倍(P＜0.05)。

2.1.4 過(guò)表達(dá)SATB1對(duì)甲狀腺癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)因子的影響:金屬蛋白酶MMPs及炎性因子是促腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境非常重要的因素,通過(guò)qRT-PCR結(jié)果,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SATB1后MMP2、MMP9 RNA表達(dá)水平分別增加(3.90±0.23)、(2.50±0.10)倍,IL-6、IL-8 RNA表達(dá)水平分別增加(1.90±0.09)、(1.50±0.06)倍。

2.1.5 過(guò)表達(dá)SATB1對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響:細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)SATB1的SW-597細(xì)胞24h愈合率約84%,而空質(zhì)粒對(duì)照細(xì)胞愈合率約為52%,提示轉(zhuǎn)染SATB1后能明顯增加SW-597細(xì)胞的遷移能力。Transwell結(jié)果也顯示,過(guò)表達(dá)SATB1后SW-579細(xì)胞遷移侵襲能力明顯增加,過(guò)表達(dá)SATB1的SW-597細(xì)胞與空質(zhì)粒組SW-597細(xì)胞遷移數(shù)分別為(196±10)個(gè)、(107±12)個(gè)(n=5,P＜0.01)。侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(158±12)個(gè)、(86±15)個(gè)(n=5,P＜0.01)。

2.2 SATB1調(diào)節(jié)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制

2.2.1 過(guò)表達(dá)SATB1對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響:轉(zhuǎn)染SATB1質(zhì)粒后提取細(xì)胞蛋白,用Western blotting方法檢測(cè)p-Akt及總Akt蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),增加SATB1表達(dá)后,與空載體細(xì)胞相比,總Akt蛋白量不變,而磷酸化Akt(p-Akt)表達(dá)明顯增加(見(jiàn)圖2)。

圖2 SATB1對(duì)Akt磷酸化的影響Fig.2 Effect of SATB1 on Akt phosphorylation

2.2.2 抑制PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)SATB1促甲狀腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響:轉(zhuǎn)染了SATB1的SW-579細(xì)胞按一定數(shù)量種于6孔板中,提前12h給予饑餓處理。實(shí)驗(yàn)組給予10 umol/L LY294002處理,對(duì)照組給予相同體積PBS處理。12h后通過(guò)transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力改變。結(jié)果顯示,遷移實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)小室的細(xì)胞與對(duì)照組分別為(156±12)個(gè)、(198±9)個(gè)(P＜0.05);侵襲實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)小室的細(xì)胞與對(duì)照組分別為(103±13)個(gè)、(146±15)個(gè)(P＜0.05,見(jiàn)圖3)。

圖3 LY294002對(duì)SATB1促進(jìn)的SW-597細(xì)胞遷移(A)、侵襲(B)的影響Fig.3 Effect of LY294002 onmigration(A)and invasiveness(B)of SW-597 Cell promoted by SATB1

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及到多條信號(hào)通路的調(diào)節(jié),Tamburrino A發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性甲狀腺髓樣細(xì)胞癌特別是當(dāng)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí),Akt/mTOR活化明顯增加［5］。而Uddin S等人也發(fā)現(xiàn),Leptin-R可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)甲狀腺癌進(jìn)展［6］。Kim CS研究小組通過(guò)甲狀腺癌小鼠模型證實(shí)了cAMP/PKA和MAPK信號(hào)通路的重要性,他們還發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt通路和(或)促甲狀腺激素調(diào)節(jié)的信號(hào)通路的過(guò)度激活可誘發(fā)甲狀腺癌的發(fā)生及促進(jìn)轉(zhuǎn)移［7-8］。

SATB1可上調(diào)金屬蛋白酶MMP2、MMP9以及炎性因子IL-6與IL-8的表達(dá)。PI3Ks信號(hào)參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),近年發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)軸與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［9-13］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blotting方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染SATB1后磷酸化Akt(p-Akt)表達(dá)增多,而總Akt無(wú)明顯變化,提示SATB1可激活PI3K/Akt信號(hào)通路。為了進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)現(xiàn)象。通過(guò)通路抑制劑LY294002阻斷PI3K/Akt通路后,觀察到甲狀腺癌細(xì)胞遷移侵襲能力減弱。提示PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與了SATB1對(duì)甲狀腺癌轉(zhuǎn)移的分子過(guò)程。然而,僅通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌中SATB1可能與PI3K/Akt通路有關(guān),它們之間的具體作用關(guān)系有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Chen Bo等人證實(shí)Akt可以磷酸化SATB1的絲氨酸47位點(diǎn),進(jìn)而避免SATB1解離［14］。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè) SATB1與 PI3K/Akt信號(hào)通路間存在一個(gè)調(diào)節(jié)環(huán)路,2者相互影響。一方面,SATB1可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)甲狀腺癌細(xì)胞遷移侵襲,另一方面,PI3K/Akt通路分子可磷酸化方式維持SATB1的正常形式,從而避免 SATB1被體內(nèi) caspase-3等水解酶降解,影響SATB1對(duì)下游基因的調(diào)控(見(jiàn)圖4)。

圖4 SATB1與PI3K/Akt通路之間可能的作用關(guān)系示意圖Fig.4 Interaction between SATB1 and PI3K/Akt pathway

綜上所述,本研究認(rèn)為PI3K/Akt信號(hào)通路參與了SATB1對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)過(guò)程,然而這2者之間可能存在更為復(fù)雜的關(guān)系,有待進(jìn)一步研究。此外,Wnt信號(hào)通路在SATB1對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)過(guò)程中起到重要作用,故是否存在其它的信號(hào)通路參與了SATB1對(duì)甲狀腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程,需要更深入的研究。

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(編校:譚玲)

Expression pattern and function of SATB1 in the invasiveness of thyroid carcimoma

WAN Li1,ZHENG Xu-qin2

(1.Department of General Surgery,Optical Valley of The Third Hospital ofWuhan City,Wuhan 430073,China;2.Clinical Medicine,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective To study the effect of SATB1 on invasiveness and metastasis of thyroid carcinoma cells,and to explore its molecular mechanisms to promote invasion and metastasis in thyroid carcinoma.Methods Construction of over expression plasmid for SATB1 gene,transfection of thyroid carcinoma SW-579 cells,transfection efficiency and epithelial cellmarker protein of E-cadherin and Western blottingmethod for determination of qRT-PCR(E-cadherin)and mesenchymal cellmarker vimentin(Vimentin)expression;qRT-PCR further detection of transcription factor Twist1 and Snail1,matrix metalloproteinases MMP2 and MMP9,as well as the the expression of inflammatory factors IL-6 and IL-8 changes;cellmorphology was observed under an inverted microscope;cellwound healing assay and Transwell were used to detect the expression of SATB1 after thyroid cancer cell migration,invasion ability changes.Western blotting for detection of SATB1 enhanced the expression changes of Akt phosphorylation,PI3K/Akt pathway inhibitor LY294002 cellswas observed after overexpression of SATB1 in SW579 cellmigration and invasion ability changes.Results The experimental results showed that cellmigration,over expression of SATB1 after each perspective transfer cells(196±10),compared with the control group(107±12),had a significantly increased(P＜0.01);invasion and experimental results showd that,after overexpression of SATB1 through the Matrigel cell number(158±12),compared with the control group(86±15),which significantly increased(P＜0.01).Western blotting found that after the transfection of SATB1 in total Akt protein,no change of circumstances,SW-579 cells,the phosphorylation of Akt(p-Akt)increased significantly.But suppressed by PI3K/Akt signaling pathway inhibitor LY294002,observed cellmigration and invasion ability decreased significantly.Conclusion SATB1 is associated with invasion and metastasis of thyroid carcinoma;its high expression is the promotion of thyroid carcinoma cell EMT in vitro;PI3K/Akt signaling pathwaymay be involved in promoting the transfer process of SATB1.Further confirmation and molecular SATB1 inmetastatic thyroid cancer cellsin themechanism of action in vivo test,may provide the experimental basis for potential intervention targets for inhibition ofmetastasis of thyroid cancer.

thyroid carcinoma;SATB1;metastasis;PI3K/Akt

R736

A

1005-1678（2014)06-0018-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(81102032)

萬(wàn)里，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：普外科，E-mail：qch1821460024@163.com。