低溫幾丁質酶生產菌的篩選鑒定與產酶條件研究

王曉輝，張慶芳，遲乃玉

（大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622）

幾丁質(Chitin)又稱甲殼素、甲殼質，是由 β-1，4-N-乙酰-D-氨基葡萄糖組成的直鏈多聚物，其含量在自然界中僅次于纖維素居第二位，據(jù)報道，海洋環(huán)境中每年就有超過 1011噸幾丁質形成[1-2]。幾丁質是多數(shù)真菌細胞壁的主要成分，同時也存在于昆蟲的外殼和腸道中。幾丁質的降解產物幾丁寡糖、殼聚糖等低聚寡糖及 N-乙酰氨基葡萄糖等具有抗菌、抗腫瘤等活性，幾丁質及其衍生物在化工、食品、化妝品、印染、造紙、農業(yè)、環(huán)保等方面都有廣泛用途[3-4]。自然界中幾丁質的降解主要通過產幾丁質酶的微生物代謝完成。

幾丁質酶(Chitinase，EC3.2.1.14)是專一降解幾丁質為幾丁寡糖或幾丁單糖的一組酶的總稱[5]。主要由內切幾丁質酶（chitinase，EC 3.2.1.14）、外切幾丁質酶（chitinase，EC 3.2.1.14）和 β-N-乙酰己糖胺酶（β-N-acetylhexosaminidase，EC 3.2.1.52）組成。內切幾丁質酶在高聚幾丁質鏈內隨機切割生成幾丁質寡糖（chitooligosaccharides, (GlcNAc)n, n>2）；外切幾丁質酶有兩種，分別從高聚幾丁質鏈的還原端和非還原端依次切割下(GlcNAc)2；β-N-乙酰己糖胺酶將從非還原端將幾丁質寡糖切割成為GlcNAc。某些物種中還發(fā)現(xiàn)了幾丁質結合蛋白，起到分散幾丁質糖鏈束的作用[5-6]。根據(jù)幾丁質酶氨基酸序列同源性不同，將其分為18和19兩個家族。其中，18家族幾丁質酶廣泛存在于病毒、微生物、植物和動物中，而 19家族幾丁質酶主要存在于植物中。此外，在鏈霉菌屬和部分擬諾卡氏菌屬的放線菌中也發(fā)現(xiàn)了19家族幾丁質酶，18家族和19家族幾丁質酶之間沒有序列相似性，說明它們由不同祖先進化而來[6]。

在海洋環(huán)境中，幾丁質是最重要的營養(yǎng)源和能源[7]。海洋約占地球表面積的70%，具有高鹽（3.5%）、高壓（＞100 Mpa）、低溫、低光照、寡營養(yǎng)等特點，以及無光照、局部高溫（400 ℃）等極端生態(tài)環(huán)境，其中平均溫度為5℃的海水占總海水的90%，為適應低溫環(huán)境，在其中生活的微生物，必然具備低溫環(huán)境下高催化活性的酶系[8-10]。本研究從海洋底泥樣品中篩到高產低溫幾丁質酶菌株，并通過形態(tài)學對其進行鑒定，詳細優(yōu)化其生長特性與產酶條件，旨在獲得新酶源微生物資源，為酶的克隆表達及工業(yè)生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品采自中國遼寧大連渤海海域近海底泥 5～100 m（123。396，E, 39。7014，N），樣品采集后迅速裝入無菌保鮮袋凍存于-20 ℃冰柜，運回實驗室后轉至-80 ℃。

1.2 試劑與儀器

幾丁質粉chitin (C8H13NO5)n，N-乙酰氨基葡萄糖購自美國 Sigma-aldrich公司,胰蛋白胨 (Tryptone)購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其它均為國產分析純試劑。

LRH系列生活培養(yǎng)箱、HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠；IX73型顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 膠體幾丁質的制備[11]

取10.0 g幾丁質置于研缽，于通風櫥內緩慢加入100 mL，85%的濃磷酸，同時不斷的用玻璃棒充分攪拌。將研缽用保鮮膜封口，4℃下過夜。然后，用大量的蒸餾水沖洗，直到pH為5.0左右后離心，用緩沖液（如0.1 M磷酸緩沖液，pH7.0）定容為1 L。配制成1%膠體幾丁質溶液，避光保存于冰箱備用。

1.4 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：膠體幾丁質10.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，原地海水配制，pH自然；

2216E種子培養(yǎng)基[11]：牛肉膏1.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，原地海水配制，pH自然；

發(fā)酵培養(yǎng)基：膠體幾丁質5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，原地海水配制，pH自然；

2216E保藏培養(yǎng)基[11]：牛肉膏1.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，原地海水配制，pH自然。

1.5 酶活檢測

取粗酶液0.1 mL與0.9 mL，1%膠體幾丁質混合，20℃下保溫30 min后，將反應混合物加熱在沸水浴中10 min終止酶反應，10,000×g離心5 min，取上清0.5 mL，加入 1 mL Schales’試劑[12]，沸水浴 10 min，測定OD420nm，設3個重復，取平均值，根據(jù)N-D--乙酰氨基葡萄糖標準曲線計算酶活力。酶活單位定義(U)：在上述條件下，每分鐘催化產生l μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量。

1.6 產低溫幾丁質酶菌株的篩選方法

1.6.1 菌株的初篩

稱取10.0 g海洋底泥，放入盛有90 mL無菌水及玻璃珠的三角瓶中，150 r/min振蕩15 min使樣品充分分散混勻，按梯度（10-5，10-6等）稀釋后涂布于含有膠體幾丁質的篩選培養(yǎng)基平板。20℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取產生透明圈比較明顯的菌株進行多次劃線純化，并結合顯微鏡觀察得到純菌株。

1.6.2 產低溫幾丁質酶菌株的復篩

將單菌落挑取一環(huán)，接種于5 mL種子培養(yǎng)基，

參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]。

1.8 生長曲線與產酶曲線的測定

1.8.1 生長曲線的測定

挑取單菌落接入5 mL，2216E液體種子培養(yǎng)基，20℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，種子液以1%的接種量轉接于裝有100 mL，2216E的液體種子培養(yǎng)基中，做3瓶，每隔2或4 h取樣測OD600nm，取平均值，繪制生長曲線。

1.8.2 產酶曲線的測定

挑取單菌落接入5 mL，2216E種子培養(yǎng)基，20℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，種子液以1%的接種量轉接于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，做3瓶，每隔2 h取樣測酶活。20℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。種子液以1%的接種量轉接于50 mL產酶發(fā)酵培養(yǎng)基，20 ℃、150 r/min培養(yǎng)3d后取樣，將發(fā)酵液12000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液測酶活。

1.7 菌株鑒定

1.9 產酶條件試驗

挑取單菌落接入5 mL2216E種子培養(yǎng)基中，在20℃下、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于不同碳源、氮源、溫度、pH、接種量、裝液量、轉速條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)30 h，測定酶活性，考察不同產酶條件對低溫幾丁質產生菌的影響。

2 結果與討論

2.1 產低溫幾丁質酶菌株篩選與鑒定

采用膠體幾丁質為唯一碳源的分離平板從海洋底泥樣品中初篩出菌株，然后將菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基制備粗酶液檢測酶活，進一步確認該菌株產低溫幾丁質酶。采用雙重指標進行篩選，能有效避免篩選出假陽性菌株，獲取真正產低溫幾丁質酶穩(wěn)定且活性高的菌株。

本實驗分離到產透明圈較大的菌株13株，選取產生透明圈最大、最穩(wěn)定產酶的一株菌命名為DL-06。菌株DL-06(圖1)單個菌落呈淡黃色，半透明，圓形，隆起，表面光滑，邊緣整齊，菌苔粘稠，菌體呈桿狀，可見單個散生或形成兩個聚集，革蘭氏染色陰性。

圖1 菌株DL-06的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)（×1000）

2.2 產低溫幾丁質酶菌株生長曲線與產酶曲線測定

菌株 DL-06生長曲線與產酶隨培養(yǎng)時間的變化如圖2所示。由生長曲線可以看出，20℃培養(yǎng)時，菌株0～6 h為延滯期，6～30 h為對數(shù)期，30～50 h為穩(wěn)定期，50后緩慢進入衰亡期。同時該菌株培養(yǎng)20～30 h內其酶活呈現(xiàn)陡增態(tài)勢，30 h時酶活達最大值為1.884 U/mL，相應菌密度為最大值，30 h后發(fā)酵液中酶活逐步下降。確定該菌株最適培養(yǎng)時間為30 h。

圖2 培養(yǎng)時間對低溫幾丁質酶產生菌DL-06生長曲線及產酶影響

2.3 海洋細菌DL-06產酶條件優(yōu)化

本實驗對菌株 DL-06產低溫幾丁質酶的單因素條件進行了優(yōu)化，包括最佳碳源、最佳氮源、起始pH、溫度和接種量等優(yōu)化研究，每個因素設 3個平行。

接種低溫幾丁質酶產生菌DL-6單菌落于2216E種子培養(yǎng)基，150 r/min，20℃下培養(yǎng)14 h后，再次重新接種新鮮配制的種子培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h，用作優(yōu)化產酶單因素條件的種子。

2.3.1 碳源對產酶的影響

接種菌株 DL-06種子于分別以膠體幾丁質、粉末幾丁質、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、殼聚糖、微晶纖維素為碳源(濃度5.0 g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基，20℃，150 r/min培養(yǎng)30 h，檢測酶活。由圖3可以看出膠體幾丁質和粉狀幾丁質是菌株 DL-06較好的產酶碳源，該菌株具有較好的降解晶體狀粉末幾丁質能力，具有潛在工業(yè)應用價值。殼聚糖雖然是脫乙酰的幾丁質，但并不易于誘導產生幾丁質酶，推測該菌株利用脫乙酰碳源底物的能力相對較差；羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和微晶纖維素有一定的誘導產酶能力，說明來源于菌株 DL-06的幾丁質酶具有廣泛的底物特異性，且具備較弱的纖維素酶活性，這與纖維素和幾丁質兩大不溶晶體多糖相似結構特點相關。

圖3 碳源對菌株DL-06產幾丁質酶的影響

2.3.2 氮源對產酶的影響

菌株分別以有機氮源酵母粉、胰蛋白胨和牛肉膏，無機氮源硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉和尿素(濃度5.0 g/L)為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，20℃，150 r/min培養(yǎng)30 h，檢測酶活。結果表明菌株 DL-06利用胰蛋白胨作為氮源產酶活力較高，推測是因為胰蛋白胨這種有機氮源含有一定的生長因子等，更容易被菌體吸收利用；另外，無機氮源中尿素產酶能力較高(圖4)。

圖4 氮源對菌株DL-06產幾丁質酶的影響

2.3.3 培養(yǎng)溫度對產酶的影響

接種發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和 50℃，150 r/min 培養(yǎng) 30h，檢測酶活。由圖 5可以看出，菌株產酶最佳溫度為20℃，隨著培養(yǎng)溫度升高，產酶能力迅速降低，表明菌株適合低溫產酶，分泌低溫幾丁質酶。

圖5 培養(yǎng)溫度對菌株DL-06產幾丁質酶的影響

2.3.4 起始pH對產酶的影響

接種pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的發(fā)酵培養(yǎng)基，20℃，150 r/min培養(yǎng)30 h，檢測酶活。結果表明菌株DL-06在pH7.0時產酶活力最高，為4.129 U/mL，pH 12.0時菌株仍保持48%的酶活力，說明菌株比較適合堿性的產酶環(huán)境，這可能與其分離環(huán)境渤海灣水域底泥偏堿性有關(圖 6)。

圖6 起始pH值對菌株DL-06產幾丁質酶的影響

2.3.5 接種量對產酶的影響

由圖7可以看出，海洋菌株在不同接種量下，幾丁質酶活力區(qū)別明顯。從圖中走勢可以看出，當接種量為2%時，幾丁質酶產量最高。此后，接種量越大酶活越低，由于250 mL三角瓶發(fā)酵體積較小，如果接種量過大，菌種大量繁殖，快速消耗營養(yǎng)物質，不利于菌種產酶，但接種量較小，發(fā)酵液中營養(yǎng)相對豐富，有利于縮短延滯期，快速進入對數(shù)生長期，利于菌種產酶。故2%為海洋菌株的最佳產酶發(fā)酵接種量。

2.3.6 裝瓶量對產酶的影響

由圖8可以看出，海洋菌株在裝瓶量為60%較高，低于或高于此酶活力均較低。由于裝瓶量主要影響的是溶氧含量，可知該菌種對溶氧量要求并不嚴苛。由此，裝瓶量60%為海洋菌株的最佳產酶發(fā)酵溫度。

圖7 接種量對產幾丁質酶的影響

圖8 裝瓶量量對菌株DL-06產幾丁質酶的影響

2.3.7 轉速對產酶的影響

選取搖床轉速為70 r/min、90 r/min、110 r/min、130 r/min、150 r/min、170 r/min，20℃培養(yǎng)30 h測定酶活力，結果見圖9。菌株產酶受轉速影響較小，當轉速為 130 r/min時酶活力達到最大值，為 2.737 U/mL。轉速為70 r/min時酶活最低為0.897 U/mL，仍保持32.7%酶活。表明該菌種為兼性厭氧菌，雖然該菌在有氧條件下比無氧條件下生長好，但厭氧環(huán)境更易產酶。因此培養(yǎng)轉速確定為130 r/min。

圖9 轉速對產酶的影響

2.4 最佳產酶條件下產幾丁質酶活力的測定

通過細菌 DL-06產低溫幾丁質酶條件的優(yōu)化，其產酶量有所增加，以最佳的產酶條件發(fā)酵菌株DL-06產低溫幾丁質酶。即膠體幾丁質5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，20℃，pH 7.0，2%接種量，裝液量60%，130 r/min，陳海水1.0 L，發(fā)酵30 h，檢測酶活力達6.87 U/mL。

3 結論與討論

本研究采用膠體幾丁質為唯一碳源的培養(yǎng)基，對采自大連渤海底泥樣品進行菌株初篩，然后酶活力檢測復篩得到1株產幾丁質酶活力較高的菌株，經形態(tài)學鑒定為革蘭氏陰性桿菌。目前文獻所報道菌株產幾丁質酶活力高低不同，且酶活測定方法、酶活單位的定義及表示方式等差別，給菌株之間酶活力大小的比較帶來不便[14-15]。

一般微生物幾丁質酶反應的最適溫度為40～50℃[16-17]，且在高溫下容易失活。我們篩選菌株DL-06分泌的幾丁質酶最適作用溫度為20℃，屬于低溫幾丁質酶，該酶作用溫度接近于室溫環(huán)境，省去工業(yè)生產中冷卻與加熱環(huán)節(jié)，不僅節(jié)約能源且降解生產成本，具有工業(yè)開發(fā)應用價值。據(jù)報道[18]幾丁質酶最適催化pH范圍較大，多在pH 3.0～11.0，但絕大多數(shù)微生物產幾丁質酶最適催化 pH 4.0～6.0的偏酸環(huán)境，pH 3.0～11.0時通常都比較穩(wěn)定。本實驗菌株DL-06分泌的幾丁質酶最適催化pH 7.0，屬于中性幾丁質酶，但在pH 12.0仍有較高酶活性，有一定嗜堿性。幾丁質酶多為誘導酶，培養(yǎng)基中需要幾丁質或幾丁質衍生物等底物的誘導，本研究菌株 DL-06也是一樣，且本研究菌株具有較高降解粉狀幾丁質能力，同時還表現(xiàn)較弱的纖維素酶活性，具有潛在應用前景。

本實驗篩選到產幾丁質酶活力較高的海洋細菌DL-06，通過單因素方法優(yōu)化其最佳的產酶條件，優(yōu)化后該菌產酶活性較高達6.87 U/mL。該菌產低溫幾丁質酶具有潛在工業(yè)生產與應用價值，為下一步系統(tǒng)的研究其幾丁質酶系及其編碼基因做好了基礎工作。

[1]Claudiana P, Souza & Bianca C, Almeida, et al. The importance of chitin in the marine environment [J]. Mar Biotechnol, 2011, 13(5): 823-830.

[2]Tsujibo H, Orikoshi H, ShiotaniK, et al.Characterization of chitinase C from a marine bacterium, Alteromonas sp. strain O-7, and its corresponding gene and domain structure [J].Appl Environ Microbiol, 1998, 64(2): 472-478.

[3]Horn SJ, Sikorski P, Cederkvist JB, et al.Costs and benefits of processivity in enzymatic degradation of recalcitrant polysaccharides [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(48):18089-18094.

[4]Aam BB, Heggset EB, Norberg AL, et al. Production of chitooligosaccharides and their potential applications in medicine [J]. Mar Drugs, 2010, 8:1482-1517.

[5]Eleni Stefanidi, Constantinos E. Vorgias Molecular analysis of the gene encoding a new chitinase from the marine psychrophilic bacterium Moritella marina and biochemical characterization of the recombinant enzyme [J].Extremophiles, 2008, 12: 541-552.

[6]Ha Ju Park, et al. Characteristics of cold-adaptive endochitinase from Antarctic bacteriumSanguibacter antarcticusKOPRI 21702 [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2009(45): 391-396.

[7]Yue Han, Bingjie Yang, Fengli Zhang, et al. Characterization of antifungal chitinase from marine streptomyces sp. DA11 Associated with South China Sea Sponge Craniella Australiensis[J]. Mar Biotechnol, 2009, 11: 132-140.

[8]Jang MS,Lee YM,Cho YS, et al. Overexpression and characterization of a novel chitinase gene from a marine bacterium Pseudomonas sp. BK1 [J].Indian J Biochem Biophys,2005, 2(6): 339-344.

[9]Wipa Suginta, et al. An endochitinase A from Vibrio carchariae: cloning, expression, mass and sequence analyses,and chitin hydrolysis [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2004(424): 171-180.

[10]Vincent G H Eijsink, Gustav Vaaje-Kolstad, Kjell M.V?rum, et al.Towards new enzymes for biofuels: lessons from chitinase research [J].Trends Biotechnol, 2008, 26(5):228-235.

[11]S C Hsu, J L Lockwood. Powdered chitin agar as a selective medium for enumeration of actinomycetes in water and soil[J]. Appl Microbiol, 1975, 29(3): 422-466.

[12]Imoto T, Yagishita K.A simple activity measurement of lysozyme [J]. Agric Biol Chem, 1971, 35(7): 1154-1156.

[13]東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版, 2001.

[14]王海東, 陳飚, 倫鏡盛, 等. 產幾丁質酶菌株SWCH-6的篩選、鑒定及其產酶條件的優(yōu)化研究[J]. 微生物學通報,2008, 35(S): 705-711.

[15]丁秀瓊, 張莉, 劉世貴, 等. 幾丁質酶產生菌 C4發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)及其對 Bt的增效作用研究[J]. 四川大學學報,2007, 44(2): 425-429．

[16]Marina Duarte Pinto Lobo, Fredy Davi Albuquerque Silva,Patrícia Gadelha de Castro Landim, et al. Expression and efficient secretion of a functional chitinase from Chromobacterium violaceum in Escherichia coli [J]. BMC Biotechnology, 2013, 13:46.

[17]連明珠. 南極Pseudoalteromonas sp.AC444低溫幾丁質酶性質分析與基因克隆及普里茲灣深海沉積物中幾丁質酶基因多樣性研究[J]. 廈門大學學報: 自然科學版, 2006,6(19): 19-24.

[18]Aizi Nor Mazila Ramli, Nor Muhammad Mahadi, Amir Rabu, et al. Molecular cloning, expression and biochemical characterisation of a cold-adapted novel recombinant chitinase from Glaciozyma antarctica PI12 [J]. Microbial Cell Factories, 2011, 10(1): 94.