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    海藻玉壺湯對甲狀腺癌荷瘤小鼠趨化因子受體CXCR4的影響研究

    2014-09-18 05:56:36張勤良關(guān)琪
    中國生化藥物雜志 2014年2期
    關(guān)鍵詞:玉壺荷瘤趨化因子

    張勤良,關(guān)琪

    (1.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院 肛腸科,遼寧 沈陽 110024;2.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院 檢驗科,遼寧 沈陽 110024)

    海藻玉壺湯對甲狀腺癌荷瘤小鼠趨化因子受體CXCR4的影響研究

    張勤良1,關(guān)琪2Δ

    (1.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院 肛腸科,遼寧 沈陽 110024;2.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院 檢驗科,遼寧 沈陽 110024)

    目的研究海藻玉壺湯對荷瘤小鼠實體瘤中趨化因子受體CXCR4表達的影響。方法體外培養(yǎng)人甲狀腺癌TT細胞,接種健康BALB/c小鼠30只,荷瘤成功后給予海藻玉壺湯治療,實驗分組為:荷瘤對照組(n=10),海藻玉壺湯高劑量組(n=10)及海藻玉壺湯低劑量組(n=10),觀察小鼠腫瘤生長情況計算抑瘤率。取實體瘤后,免疫組化法檢測趨化因子受體CXCR4的表達,利用實時定量PCR(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測CXCR 4 mRNA的表達。結(jié)果同荷瘤對照組相比,海藻玉壺湯高低劑量組在蛋白和基因?qū)哟紊辖档土粟吇蜃邮荏wCXCR4的表達,該影響對濃度呈一定的依賴性。結(jié)論海藻玉壺湯可降低趨化因子受體CXCR4的表達。

    海藻玉壺湯;CXCR 4;人甲狀腺癌細胞;BALB/c小鼠

    1.2 方法

    1.2.1 海藻玉壺湯煎劑的制備 根據(jù)2010年《中華人民共和國藥典》中規(guī)定海藻玉壺湯的用藥劑量,海藻30 g,昆布15 g,貝母15 g,法半夏10 g,獨活10 g,青皮5 g,陳皮10 g,當歸10 g,川芎10 g,連翹10 g,甘草10 g,海帶5 g配伍后加10倍水浸泡過夜,按照生藥5.82 g/kg(高劑量)、生藥1.46 g/kg(低劑量)煎煮3次,每次30 min,過濾,濃縮至每1 mL含生藥1 g的水煮液,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 動物分組與處理 BALB/c小鼠30只,按照隨機數(shù)字表分成3組,實驗分組為:荷瘤對照組(n=10),海藻玉壺湯低劑量組(n=10)及海藻玉壺湯高劑量組(n=10),小鼠均于背部注射甲狀腺癌TT細胞懸液0.1 mL(約2×106個),4 w后成瘤開始用藥。荷瘤對照組予生理鹽水灌胃,0.5 mL/只,日2次;海藻玉壺湯低劑量組予低劑量海藻玉壺湯灌胃,0.5 mL/只,日2次;海藻玉壺湯高劑量組予高劑量海藻玉壺湯灌胃,0.5 mL/只,日2次。小鼠成瘤后,1周2次觀察接種腫瘤的生長并用游標卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的最長徑a和最短徑b,根據(jù)公式計算腫瘤體積:V(mm 3)=1/6 π(ab2)。用藥3周后,處死小鼠,剝離實體瘤,稱量濕重,根據(jù)公式計算抑瘤率:腫瘤抑瘤率(%)=[1-(平均實驗組瘤重/平均對照組瘤重)]×100%。

    1.2.3 免疫組織化學法檢測CXCR4蛋白表達 將造模后BALB/c小鼠的瘤組織,經(jīng)10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚5μm。切片脫蠟至水。滴加5%BSA封閉液,室溫10 min。甩去多余液體,不洗。滴加兔抗鼠CXCR4抗體,4℃冰箱中過夜,PBS(pH 7.2~pH 7.6)洗 2 min×3 次。滴加生物素化山羊抗兔IgG,37℃ 20 min。PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC,20℃~37℃20 min。PBS洗5 min×4次。DAB顯色,光鏡下控制反應時間,蒸餾水洗滌。蘇木素輕度復染。顯微鏡下拍照觀察。用Quantity One圖像分析軟件進行分析,以細胞漿/膜或核中出現(xiàn)粗細一致的棕黃色顆粒作為陽性,隨機取5個視野,在400倍高倍鏡下,計數(shù)細胞,測出陽性反應細胞的總面積和積分光密度,求出平均光密度。

    1.2.4 RT-PCR檢測mRNA表達 取冷凍保存的實體瘤組織 0.1~0.2 g,采用 Tr i z o l法提取組織RNA,按照說明書步驟進行。CXCR4引物序列:上游引物 5'-GGAGGGGATCAGTATATACA-3',下游引物5'-GAAGATGGAGTAGATGG-3',145 bp;內(nèi)參序列:上游引物5'-GAAGGTCAAGGTCGGAGTC-3',下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3',226 bp;25 μL 反應體系,預變性94℃1 min,退火60℃1 min,延伸72℃2 min,循環(huán)35次。余按試劑盒說明進行操作,用反應產(chǎn)物的吸光度與內(nèi)參的比值表示該基因表達強度。

    1.3 統(tǒng)計學方法 用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,正態(tài)計量資料用“±s”表示,組間比較用采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 海藻玉壺湯對小鼠腫瘤的影響 與同期未治療的荷瘤對照組小鼠比較,經(jīng)海藻玉壺湯治療后的小鼠出現(xiàn)腫瘤生長減緩現(xiàn)象(見圖1)。取材后稱取瘤重可知,荷瘤對照組小鼠瘤重為(2.16±0.78)g,海藻玉壺湯高劑量組小鼠瘤重為(1.49±0.56)g,抑瘤率為31.0%;海藻玉壺湯低劑量組小鼠瘤重為(1.26±0.77)g,抑瘤率為 41.7%。

    圖1 不同組別腫瘤的體積Fig.1 Tumor volume of different groups

    2.2 免疫組織化學法檢測CXCR4表達 荷瘤對照組CXCR4蛋白表達較多,呈深棕色。海藻玉壺湯高低劑量組腫瘤細胞胞膜及胞漿上CXCR4蛋白表達較少。通過計算AOD值可知,海藻玉壺湯低劑量組和海藻玉壺湯高劑量組同荷瘤對照組相比,CXCR4蛋白表達均顯著降低(P<0.05),海藻玉壺湯高劑量組同海藻玉壺湯低劑量組相比,CXCR4蛋白表達顯著降低(P<0.05,見圖 2、表 1)。

    圖2 不同組CXCR4蛋白的表達(×400)Fig.2 The expression of different groups of CXCR 4 protein(×400)

    表1 CXCR4蛋白表達的AOD值Tab.1 AOD for CXCR 4 expression

    2.3 RT-PCR檢測CXCR4 mRNA的表達 采用RTPCR方法檢測CXCR4 mRNA表達,海藻玉壺湯高、低劑量組mRNA同荷瘤對照組相比,表達均顯著降低(P<0.05),但海藻玉壺湯高低劑量組之間無顯著差異(見圖3)。

    Fig.3 mRNA expression of CXCR 4 detected by RT-PCR*P<0.05, compared with tumor-bearing mice control group

    3 討論

    趨化因子由一系列分子量為8~12 kDa的分泌型小分子多肽組成的家族[4-6],由1992年第二屆關(guān)于趨化作用細胞因子討論大會上命名,屬跨膜G蛋白偶聯(lián)受體超家族,參與多種生理和病理過程。趨化因子受體CXCR4在惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移中有重要作用,與惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[7-9]。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中,無甲狀腺癌一類名詞,辯證當屬“癭瘤”?!锻饪普?癭瘤論》云:“夫人生癭瘤之癥,非陰陽正氣結(jié)腫,乃五臟瘀血、濁氣、痰滯而成”[10-11]?!锻饪拼蟪伞芬嘣疲骸胺虬`瘤者,由五臟邪火濁氣,瘀血痰滯,各有所感而成?!睂ζ渲委?,提出了經(jīng)典方藥海藻玉壺湯[12-13]。大量實踐也表明類似海藻玉壺湯以益氣養(yǎng)血、軟堅散結(jié)兼活血化瘀的中藥對甲狀腺癌患者,在臨床癥狀方面具有一定效果,同時可以降低血清甲狀腺球蛋白水平[14-15],本實驗主要建立甲狀腺癌TT細胞裸鼠模型,探究該經(jīng)典復方對甲狀腺癌療效的影響,為研究作用機理提供實驗依據(jù)。由結(jié)果可以看出,海藻玉壺湯能夠使小鼠出現(xiàn)腫瘤生長減緩現(xiàn)象,并且降低趨化因子受體CXCR4的表達。其中蛋白水平上,海藻玉壺湯高劑量組效果優(yōu)于海藻玉壺湯低劑量組(P<0.05),而基因水平上二者相差不大。這說明,海藻玉壺湯對甲狀腺癌的抑制作用,這與王業(yè)生[16]等人研究結(jié)論一致,可能與改變趨化因子受體CXCR4的表達有關(guān),具體機制有待進一步研究。

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    Effects of Haizao Yuhu Decoction on chemokine receptor CXCR4 in TT cell tumor-bearing mice

    ZHANG Qin-liang1, GUAN Qi2Δ
    (1.Department of Anorectal Disease, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024 China;2.Department of Medical Laboratory, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, China)

    ObjectiveTo observe the effects of Haizao Yuhu Decoction on the CXCR 4 expression of TT cell tumor-bearing mice.MethodsCulture the human thyroid TT cells in vitro, and inoculate them into 30 healthy mice BALB/C. Subsequently, Haizao Yuhu Decoction was given to the tumor-bearing mice. They are grouped into three groups, including tumor-bearing group (n=10), Haizao Yuhu Decoction high dosage group(n=10) and Haizao Yuhu Decoction low dosage group (n=10) to observe the tumor growth to calculate the anti-tumor rate. After the tumor has been reaped, immunohistochemical is adopted to test the expressions of chemotactic factor receptor—CXCR 4 on protein level. RT-PCR is used to test the expressions of CXCR 4 on genetic level.ResultsComparing with the tumor-bearing group, HZYHD high-dosage group has decreased the expressions of CXCR 4 on both the protein and genetic levels, which is to certain degree dependent on concentration.ConclusionHaizao Yuhu Decoction could decrease the expression of CXCR 4.

    HaizaoYuhu Decoction;CXCR 4;TT cell;BALB/c mice

    R 453.9

    A

    1005-1678(2014)02-0042-03

    海藻玉壺湯出自《外科正宗》,由海藻、貝母、陳皮、青皮、昆布等12味中藥組成,是傳統(tǒng)治療癭病之方,廣泛應用于以瘰疬為主要臨床特征的疾病[1-2]。趨化因子(chemoattractant cytokines,CK)是指機體內(nèi)一群能使細胞發(fā)生趨化運動的小分子細胞因子,在抗感染和免疫中起關(guān)鍵性作用。已有研究證明[3],趨化因子的家族成員CXCR4,同在多種惡性腫瘤中表達相關(guān),特別是在甲狀腺癌中有很高的強陽性表達率,隨著病理分化程度的降低,強陽性的表達率逐漸升高。本實驗通過建立甲狀腺癌TT細胞荷瘤小鼠模型,通過不同濃度海藻玉壺湯對其進行處理,觀察小鼠腫瘤生長情況,計算抑瘤率,并通過生物學實驗方法檢測實體瘤上趨化因子CXCR4表達情況,探究該經(jīng)典復方對甲狀腺癌療效的影響,為研究該方藥的作用機理提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與試劑 甲狀腺癌TT細胞株購自中國醫(yī)學院腫瘤研究中心(北京);SPF級BALB/c小鼠30只,雌雄各半購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證編號:scxk(京)2011-0011;胎牛血清購于Hyclone(貨號:SH 30084.03);DMEM培養(yǎng)基購于北京鼎國(貨號:CC 0031);RIPA裂解液購于北京鼎國(貨號:WB-0071);海藻玉壺湯材購自北京同仁堂藥店;熒光定量PCR儀購于ABI公司(9700型)。

    遼寧省自然科學基金(201102150)

    張勤良,男,碩士,副主任醫(yī)師,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合治療肛門結(jié)腸病基礎(chǔ)和臨床,E-mail:zql_1681@163.com;關(guān)琪,通信作者,男,博士,主任檢驗師,研究方向:抗腫瘤及抗病毒免疫,E-mail:guanqi 1231@sina.com。

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