多粘菌素B與美羅培南聯(lián)合用藥對(duì)泛耐藥銅綠假單胞菌體外抗菌活性的研究

劉立凡，陳佰義

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 沈陽 110035；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 感染科，遼寧 沈陽 110001）

多粘菌素B與美羅培南聯(lián)合用藥對(duì)泛耐藥銅綠假單胞菌體外抗菌活性的研究

劉立凡1，陳佰義2

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 沈陽 110035；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 感染科，遼寧 沈陽 110001）

目的評(píng)價(jià)多粘菌素B與美羅培南體外聯(lián)合應(yīng)用對(duì)臨床分離的30株泛耐藥銅綠假單胞菌的抗菌效應(yīng)。方法采用微量肉湯稀釋法和棋盤法測定多粘菌素B與美羅培南單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥后，臨床分離的30株泛耐藥的銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），及計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC），根據(jù)FIC指數(shù)判定聯(lián)合效應(yīng)類型，判斷是否有協(xié)同或拮抗作用。結(jié)果多粘菌素B與美羅培南聯(lián)用后，藥物對(duì)泛耐藥銅綠假單胞菌的MIC值均顯著降低，F(xiàn)IC指數(shù)在0～0．5百分率為60%；FIC指數(shù)在0．5～1．0的百分率為30%。結(jié)論多粘菌素B與美羅培南聯(lián)合用藥后，以協(xié)同作用和相加作用為主，測定出分離的30株泛耐藥銅綠假單胞菌的抗菌作用無拮抗作用。

泛耐藥銅綠假單胞菌；多粘菌素B；美羅培南；聯(lián)合用藥；聯(lián)合藥物抑菌濃度

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2011年01月～2012年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病房銅綠假單胞菌進(jìn)行分離，并隨機(jī)選取泛耐藥菌株30株（重癥加強(qiáng)護(hù)理病房8株，呼吸病房6株，神經(jīng)外科病房4株，神經(jīng)內(nèi)科病房2株），其中痰液標(biāo)本28株，切口分泌物標(biāo)本2株。為避免重復(fù)收集同一患者菌株，所有菌株均經(jīng)過全自動(dòng)微生物分析儀VITEK-2（購自法國Biomerieux公司，VITEK 32）細(xì)菌鑒定儀鑒定，采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷[5]。質(zhì)控菌株：銅綠假單胞菌ATCC 27853，購于上海復(fù)祥生物科技有限公司。

1.1.2 抗菌藥物 多粘菌素B（購自美國Amresco公司，BY 09059），美羅培南（購自中國藥品生物制品檢定所，BZ 2659）。

1.1.3 試劑及設(shè)備 Muller-Hinton(MH)瓊脂培養(yǎng)基、肉湯（美國 Difco 公司，批號(hào)：200020919），96孔平板（美國Corning公司，型號(hào)：15041），VITEK全自動(dòng)細(xì)菌分析儀（法國生物梅里埃公司，SH 11）、WGZ-2比濁儀（法國生物梅里埃公司），微量加樣器（美國 Eppendorf公司，M 318928）。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液配制 挑取已分純、過夜的新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌3～5個(gè)菌落，置于水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）肉湯中接種，進(jìn)行6 h增菌培養(yǎng)。按0.5 McFarland標(biāo)準(zhǔn)，在增菌培養(yǎng)后的菌液中注入3 mL MH肉湯校正其濁度，按5×105CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)用MH肉湯對(duì)菌液進(jìn)行稀釋。

1.2.2 抗菌藥物儲(chǔ)備液配制 用電子天平稱取美羅培南、多粘菌素B（組合比例為1：1）適量，配制成濃度為5120 μg/mL的儲(chǔ)備液。

1.2.3 微量肉湯稀釋法 按 256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL、0.06 μg/mL、0.03 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)，用無菌水將每種抗菌藥物依次倍比稀釋成14個(gè)濃度。采用微量肉湯稀釋法，測定多粘菌素和美羅培南對(duì)30株泛耐藥菌株MIC，參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)為判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，采用棋盤設(shè)計(jì)法，在96孔板的橫列和縱列中將不同濃度的2種藥物各50 μL兩兩組合分別加入，不同濃度組合的2種藥物混合液置于各孔中，然后在已混合溶液中加入100 μL菌液，最后輕微振蕩混勻各孔溶液，置于37℃溫箱進(jìn)行16～20 h培養(yǎng)，觀察結(jié)果。將分別應(yīng)用2藥的MIC值多粘菌素單獨(dú)用藥和MIC美羅培南單獨(dú)用藥及選擇最佳聯(lián)合用藥效應(yīng)時(shí)各自的MIC多粘菌素聯(lián)合用藥和MIC美羅培南聯(lián)合用藥記錄結(jié)果，計(jì)算 MIC 幾何均數(shù)（MICG）、50%抑菌濃度（MIC 50）、90%抑菌濃度（MIC 90），最后計(jì)算FIC指數(shù)。

1.2.4 聯(lián)合藥物分級(jí)抑菌濃度（FIC）指數(shù)的計(jì)算與效應(yīng)類別判定[7]FIC指數(shù)＝MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單獨(dú)用藥＋MIC乙藥聯(lián)合用藥/MIC乙藥單獨(dú)用藥。FIC指數(shù)＞2.0為拮抗作用，1.0＜FIC指數(shù)≤2.0為無關(guān)作用，0.5＜FIC指數(shù)≤1.0為相加作用，F(xiàn)IC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用。

2 結(jié)果

2.1 計(jì)算MIC 50和MIC 90 多粘菌素B與美羅培南單獨(dú)用藥、聯(lián)合用藥進(jìn)行比較，MIC值下降，說明多粘菌素B和美羅培南聯(lián)合用藥后MIC值明顯下降（見表1）。

表1 抗菌藥物單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥對(duì)銅綠假單胞菌的MIC 50和MIC 90（μg/mL）Tab.1 MIC 50 and MIC 90 of polymyxin B and meropenem in single-use and in combination (μg/mL)

2.2 分級(jí)抑菌指數(shù)FIC構(gòu)成比 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2藥合用后FIC指數(shù)在0～0.5的為18株，占所有菌株數(shù)量的百分率為：60%；FIC指數(shù)在0.5～1的為9株，占所有菌株數(shù)量的百分率為：30%，F(xiàn)IC指數(shù)在1～2的為3株，占所有菌株數(shù)量的百分率為：10%，F(xiàn)IC指數(shù)＞2的為零。由此可見，2藥聯(lián)合用藥對(duì)泛耐藥銅綠假單胞菌抗菌作用主要為協(xié)同作用和相加作用。

3 討論

銅綠假單胞菌是最常見的非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，當(dāng)人體免疫力低下時(shí)，可成為機(jī)會(huì)致病菌，導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)院感染。銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素有天然耐藥性，耐藥機(jī)制主要包括耐藥基因突變、產(chǎn)生滅活酶、改變藥物的作用靶點(diǎn)、藥物滲透障礙與主動(dòng)外排、形成生物膜等[8]，加之廣譜抗生素的應(yīng)用、各種侵入性診斷和治療操作的不斷普及、器官移植手術(shù)的增加、腫瘤放化療的增加，使得銅綠假單胞菌的致病率不斷增加。加之近年來臨床中廣泛應(yīng)用、濫用廣譜抗生素，使得銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的敏感性下降，出現(xiàn)了獲得性耐藥菌株，在逐漸增多的多重耐藥和泛耐藥銅綠假單胞菌[9]出現(xiàn)的情形下，碳青霉烯類抗菌藥物就成為了臨床治療的最后一道防線，但對(duì)泛耐藥菌的治療仍為臨床醫(yī)生面臨的治療難題[10]。由于新的抗菌藥物研制的速度趕不上細(xì)菌耐藥的速度的缺乏，所以臨床上較少應(yīng)用的老藥回到了人們的視線，利用老藥聯(lián)合治療耐藥菌[11]就成了臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。

多粘菌素B是由多粘芽孢桿菌產(chǎn)生的一組多肽類抗生素，作用于革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的脂多糖，改變細(xì)菌細(xì)胞外膜滲透性，多粘菌素B被細(xì)胞攝取導(dǎo)致細(xì)菌死亡，多粘菌素B對(duì)革蘭氏陰性菌敏感性較高，但是在近幾十年中發(fā)現(xiàn)它有嚴(yán)重的神經(jīng)毒性和腎毒性，所以臨床應(yīng)用受到限制。近年來，多粘菌素在多重耐藥革蘭氏陰性菌治療方面的臨床研究有所增多[12]，與其他類抗菌藥物聯(lián)合用藥可以提高效果[13-15]。本實(shí)驗(yàn)中的30株銅綠假單胞菌對(duì)美羅培南均耐藥，而對(duì)多粘菌素B的敏感率為86.7%，無耐藥菌株，且多粘菌素B與美羅培南聯(lián)用后，各自的MIC值均顯著下降（P＜0.01）本實(shí)驗(yàn)多粘菌素B與美羅培南合用后FIC指數(shù)在0～0.5的百分率分別為：60%；FIC指數(shù)在0.5～1.0的百分率分別為：30%，說明多粘菌素B與美羅培南聯(lián)合用藥在對(duì)30株泛耐藥銅綠假單胞菌抗菌作用中，無拮抗作用，主要為協(xié)同和相加作用，本研究為泛耐藥細(xì)菌引起的難治感染的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Study on the anti-bacteria effects of polymyxin B combined with meropenem against pan-drug-resistant pseudomonas aeruginosa

LIU Li-fan1, CHEN Bai-yi2

(1.Department of Respiratory Medicine, The Second Affiliated Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110035, China;2.Department of Infectious Disease, The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China)

ObjectiveTo evaluate the anti-bacteria effects of polymyxin B combined with meropenem against 30 strains pan-drug resistant pseudomonas aeruginosa that separated in clinic.MethodsThe minimal inhibitory concentration (MICs) of 30 strains pan-drug resistant pseudomonas aeruginosa after treated with polymyxin B and meropenem as single-use or combination use were determined by both microdilution method and checkerboard method. The FIC index was calculated, then the type of combination effect was determined according to FIC index, which was used to determine whether there was synergistic or antagonistic effects.ResultsThe MICs of pan-drug resistant pseudomonas aeruginosa were reduced significantly after polymyxin B combined with meropenem when compared with single-use. The percentages of the FIC index that less than 0.5 and the index between 0.5 and 1 were 60% and 30% respectively.ConclusionThe results indicate that the combinations of polymyxin B with meropenem have good synergistic and additive effects against pan-drug resistant pseudomonas aeruginosa, there is no antagonism.

pan-drug resistant pseudomonas aeruginosa; polymyxin B; meropenem; combination; fractional inhibitory concentration

R 378．9

A

1005-1678(2014)02-0040-03

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）廣泛分布于自然界，在健康人的呼吸道、皮膚表面等部位定植，當(dāng)人體免疫力低下時(shí)，可引起呼吸道、傷口的感染，是醫(yī)院感染常見的條件致病菌之一。近年來，銅綠假單胞菌在臨床各類標(biāo)本中的分離率逐漸上升，其分離率在非發(fā)酵細(xì)菌中位居第一位[1]，可引起多臟器和多系統(tǒng)的感染[2]，特別是抗菌藥物的不規(guī)范應(yīng)用的廣泛存在，導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)臨床常用的抗菌藥物如喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、碳青霉烯類等抗菌藥物的耐藥性不斷增加，出現(xiàn)了多重耐藥（multidrug resistance，MDR）菌株，甚至衍生出對(duì)除了多粘菌素外的常用抗菌藥全部耐藥的菌株，即為泛耐藥(pandrug resance，PDR)菌株[3-4]，感染后死亡率高，使用單一抗菌藥物的治療效果不明顯，甚至出現(xiàn)直接導(dǎo)致失敗的情況，給臨床研究和醫(yī)療服務(wù)帶來了許多難題。為此，本研究探討了多粘菌素B（polymyxin B）與美羅培南（meropenem）聯(lián)合應(yīng)用對(duì)臨床分離并分純的泛耐藥銅綠假單胞菌（30株）的體外抗菌效應(yīng)，希望能為臨床聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物治療泛耐藥菌感染提供參考。

2012年沈陽市衛(wèi)生局科研課題（2011446）

劉立凡，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：免疫缺陷與條件致病菌，E-mail：liulifan_sy@163.com。