藍藻素經(jīng)Nrf 2/HO-1發(fā)揮對阿霉素心肌損傷大鼠的保護作用

羅湘玉，羅衛(wèi)民，鄭雪松，張軍

（湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院 胸心外科，湖北 十堰 442000）

藍藻素經(jīng)Nrf 2/HO-1發(fā)揮對阿霉素心肌損傷大鼠的保護作用

羅湘玉，羅衛(wèi)民Δ，鄭雪松，張軍

（湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院 胸心外科，湖北 十堰 442000）

目的觀察血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）在藻藍素（C-phycocyanin，CPC）對阿霉素（Doxorubicin，DOX）致大鼠心肌毒性的保護作用中的作用。方法60只SD大鼠隨機分為空白對照組（n=15）、DOX組（n=15）和CPC干預組（n=15）及HO-1抑制劑錫原卟啉Ⅸ（tin protoporphyrin IX，SnPP）組（n=15）?？瞻讓φ战M僅給予等體積生理鹽水，模型組采用DOX腹腔注射，使其2周內(nèi)累計劑量達15 mg/kg。CPC干預組在模型組基礎上腹腔注射濃度為20、40、60 mg/kg 的CPC。處理結(jié)束后，比色法測定血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性，同時測量心肌組織HO-1和caspase-3的活性；Western blot檢測心肌組織中HO-1的表達以及Nrf2的激活。結(jié)果與對照組相比，DOX組小鼠血清中CK、LDH和caspase-3活性顯著增高（P＜0．05），而心肌組織中HO-1活性僅輕度增高。CPC處理可明顯抑制阿霉素心肌損傷大鼠中CK、LDH和caspase-3活性，并顯著上調(diào)HO-1活性及蛋白表達水平。而SnPP處理后，與CPC組相比，大鼠血清CK、LDH以及caspase-3活性顯著降低。此外，CPC明顯促進核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的激活。結(jié)論CPC對阿霉素心肌損傷大鼠的保護機制可能是通過激活Nrf2并誘導HO-1表達有關。

藍藻素；阿霉素；血紅素氧合酶1

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑 DOX購自意大利Pharmacia公司（批號：8 NB 002-A），CPC為Sigma-Aldrich產(chǎn)品（純度均98%）。血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒為Stanbio產(chǎn)品。心肌caspase-3的比色測定試劑盒購自Quantikine。HO-1，Nrf2以及TATA盒結(jié)合蛋白（TATA binding protein，TBP）多克隆抗體購自Santa Cruz。SnPP和其他分析純試劑主要購自Sigma-Aldrich公司。主要實驗儀器：酶標儀（iMark，BIORAD），離心機（5418，Eppendorf），半干轉(zhuǎn)印儀（Trans-Blot，Bio-Rad）

1.2 實驗分組 成年雄性Wistar大鼠由湖北醫(yī)藥學院實驗動物部提供（合格證號：13061015），體重（250±5）g，在 SPF環(huán)境下給予標準實驗室的水和食物飼養(yǎng)2周。大鼠隨機分成4組（每組15只），如下：組1為對照組，大鼠接受等體積的生理鹽水作為陰性對照；組2為DOX組，大鼠連續(xù)2周每間隔48 h注射 DOX（2.5 mg/kg，ip.）共6次，使其累積劑量達15 mg/kg。組3為CPC治療組，在組2的基礎上，大鼠每日給予CPC（20，40，60 mg/kg）灌胃， DOX停止后，持續(xù)CPC灌胃4周。組4為SnPP干預組，在組3基礎上，給予20 μmol/kg SnPP腹腔注射，每周3次，持續(xù)時間同組3。

1.3 血清CK和LDH活性的測定 采用分光光度計在波長340 nm處測量CK-MB的吸光度。LDH的測量按照Stanbio公司提供的診斷試劑盒進行，計算血清總LDH的活性（U/L）。

1.4 心肌HO-1活性測定 將獲取的心肌組織勻漿18000×g 4℃離心10 min，獲取400 μL上清加到反應混合物中（含0.8 mmol/L NADPH、2 mmol/L葡糖糖-6-磷酸鹽、0.2 U葡糖糖6磷酸鹽-1脫氫酶、2 mg大鼠肝臟胞漿、100 mmol/L PBS以及10 μmol/L氯化血紅素）。反應在黑暗的環(huán)境中37℃孵育1 h后加入1mL氯仿終止反應。并在463 nm和530 nm雙波長測吸光度值（膽紅素吸光系數(shù)為40），以生成的膽紅素量表示HO-1活性，單位為nmol/（mg protein·h），并計算其與對照組的相對值。

1.5 caspase-3活性測定 50 mg心肌組織加入0.8 mL pH 7.4的裂解緩沖液中制成勻漿。10000 g 4℃離心15 min。獲取上清用于caspase-3測定。采用間接法測定caspase-3活性，基于caspase-3切除底物分子DEVD-pNA中的發(fā)光基團pNA，隨后在405 nm處用測量其吸光度，從而間接反應其活性。

1.6 Western blot檢測HO-1表達以及Nrf2核轉(zhuǎn)位 根據(jù)試劑盒（Pierce）提供的步驟提取心肌組織中的總蛋白和核蛋白，并測定其濃度。獲取100 μg蛋白用于SDS-PAGE。分離的總蛋白或核蛋白隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上（Millipore），并利用含有質(zhì)量分數(shù)為5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，隨后加入-抗、抗 HO-1（1∶500）、β-actin（1∶5000）、抗 Nrf 2（1∶1000），抗TBP（1∶1000）的抗體4℃孵育過夜。多次洗滌之后，加入HRP標記的二抗（1∶10000稀釋）孵育膜1 h。ECL法（Amersham）發(fā)光、顯影。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，并采用單因素方差分析數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CPC對血清CK-MB和LDH水平的影響 與正常組相比，DOX可導致血清LDH和CK-MB增高（P＜0.01）；與DOX處理組相比，CPC可導致血清LDH和CK-MB水平顯著降低（見表1），而SnPP處理組中LDH和CK-MB水平顯著高于CPC組（P＜0.05），但與DOX組相比差異無統(tǒng)計學意義。

表1 CPC對血清CK和LDH水平的影響Tab.1 Effect of CPC on the concentration of CK and LDH

2.2 CPC對心肌HO-1活性的影響 DOX處理后，與對照組大鼠相比，心肌組織中HO-1酶活性輕微增高。而經(jīng)60 mg/kg CPC處理后，HO-1酶活性顯著增高。而同時用SnPP處理后，HO-1酶活性顯著低于CPC組，但仍高于對照組（見圖1）。

2.3 CPC對caspase-3活性的影響 DOX處理后，心肌組織中caspase-3活性增加了55%。同時經(jīng)60 mg/kg CPC處理后，caspase-3活性有所降低，而SnPP處理能再次上調(diào)caspase-3的活性（見圖2）。

圖2 CPC對caspase-3活性的影響1. 陰性對照組；2. DOX組；3. DOX+60 mg/kg CPC組；4. DOX+60 mg/kg CPC+SnPP組*P＜0.05，與對照組相比；﹟P＜0.05與DOX組相比；△P＞0.05，與 DOX+60 mg/kg CPC 組相比Fig.2 Effect of CPC on caspase-3 activity in myocardial tissues1. Control group；2. DOX group；3. DOX+60 mg/kg CPC group；4. DOX+60 mg/kg CPC+SnPP group*P＜0.05，compared with control group；﹟P＜0.05，compared with DOX group group；△P＜0.05，compared with DOX+60 mg/kg CPC group

2.4 CPC對心肌組織中HO-1表達的影響 與對照組相比，DOX大鼠心肌組織中HO-1蛋白表達水平有輕微增高，而經(jīng)CPC處理后，HO-1表達進一步增強（見圖3）。SnPP處理能再次降低HO-1的表達。而內(nèi)參β-actin含量保持一致。

圖3 CPC對DOX心肌毒性大鼠HO-1表達的影響1. 陰性對照組；2. DOX組；3. DOX+60 mg/kg CPC組；4. DOX+60 mg/kg CPC+SnPP組Fig.3 Effect of CPC on HO-1 expression in DOX-induced myocardial injury rats1. Control group；2. DOX group；3. DOX+60 mg/kg CPC group；4. DOX+60 mg/kg CPC+SnPP group

2.5 CPC對轉(zhuǎn)錄因子Nrf2活化的影響 Westernblot結(jié)果顯示，DOX大鼠心肌組織內(nèi)細胞核中Nrf2含量與對照組相比增高不明顯，而CPC處理后，Nrf2轉(zhuǎn)位水平顯著增多，而核內(nèi)參TBP含量始終維持不變。表明CPC能促進Nrf2從細胞漿轉(zhuǎn)移至細胞核中（見圖4）。

圖4 CPC對DOX心肌毒性大鼠Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響1. 陰性對照組；2. DOX組；3. DOX+60 mg/kg CPC組；Fig.4 Effect of CPC on Nrf 2 translocation in DOX-induced myocardial injury rats1. Control group；2. DOX group；3. DOX+60 mg/kg CPC group

3 討論

DOX是一種是作用于DNA的蒽環(huán)類抗生素，它能夠?qū)NA發(fā)生嵌入作用，在臨床中應用廣泛。阿霉素的急性副作用包括惡心、嘔吐和心律不整。長期使用后，在線粒體氧化磷酸化作用下，阿霉素和鐵相互作用產(chǎn)生大量活性氧，可以破壞心肌，造成肌原纖維損傷或凋亡[6-7]。HO-1是催化血紅素降解為CO、亞鐵離子和膽紅素的限速酶，并在機體的抗炎癥、抗氧化損傷中發(fā)揮重要作用[8]，本研究顯示，DOX毒性大鼠經(jīng)CPC處理后，可顯著上調(diào)HO-1的酶活性以及其蛋白表達。HO-1基因的啟動子區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的結(jié)合位點，本研究也證實CPC能誘導Nrf2從細胞漿轉(zhuǎn)位至細胞核，從而激活Nrf2誘導HO-1表達。

Nrf2是機體一種重要的獲得性保護性核轉(zhuǎn)錄因子。在非激活情況下，Nrf2通過與抑制物keap1結(jié)合于細胞質(zhì)內(nèi)。當細胞受到外源性刺激時，Nrf2從keap1中分離出來，轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，從而與應激誘導性基因包括HO-1的啟動子區(qū)域的抗氧化劑應答元件結(jié)合[9]。本研究發(fā)現(xiàn)CPC處理后，Nrf2轉(zhuǎn)位增加，這與心肌組織中HO-1蛋白表達以及酶活性的趨勢一致，表明CPC誘導HO-1的表達可能是由于Nrf2的活化所致。HO-1發(fā)揮對細胞保護作用，主要通過它的3種產(chǎn)物——CO、膽紅素和Fe2+而實現(xiàn)的。CO是一種類似于NO的重要神經(jīng)遞質(zhì)。它通過自分泌或旁分泌的方式作用于效應的效應細胞，催化GTP生成cGMP。cGMP通過激活相應的蛋白激酶、磷酸二酯酶（phosphodiesterase）或調(diào)節(jié)離子通道而發(fā)揮相應的生理功能[10]。膽紅素也是一種比維生素E和維生素C還強的抗氧化劑，它不但可直接與自由基反應，同時也能結(jié)合單線態(tài)氧從而預防烴類的光氧化作用。Fe2+可以誘導鐵蛋白的合成，后者可減少細胞內(nèi)游離鐵的蓄積而發(fā)揮保護作用，以此對抗ROS導致的細胞損傷[11-12]。為了進一步評價HO-1在CPC的保護效應中的作用，在干預過程中加入SnPP，對CPC的保護作用進行了分析。結(jié)果表明，DOX模型大鼠血清LDH和CK-MB顯著增高，而經(jīng)CPC處理后，這些心肌損傷指標顯著降低。同時給予SnPP處理后，能顯著逆轉(zhuǎn)CPC的保護效應。這表明CPC是通過上調(diào)HO-1蛋白的表達并上調(diào)其酶活性，從而發(fā)揮對心肌細胞的保護作用。

DOX致心肌細胞損傷的機制很多，包括離子和自由基假說、代謝機制和凋亡機制。心肌細胞是終末分化細胞，多種抗腫瘤藥物可引起其壞死或凋亡，從而引起心肌細胞減少而導致心臟收縮功能不足[13]。研究顯示，DOX可通過內(nèi)源性和外源性機制引起心肌細胞凋亡，最終激活下游caspase-3，6和7。一旦caspase被激活，細胞即進入凋亡執(zhí)行階段[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，CPC可抑制DOX引發(fā)的caspase-3激活，而HO-1抑制劑SnPP處理后，caspase-3活性再次增高，這表明HO-1能在一定程度上削弱DOX的促凋亡效應，最終抑制DOX引起的心肌細胞凋亡、壞死及心肌纖維化。

綜上所述，本研究認為CPC可以促進Nrf2核轉(zhuǎn)位，從而誘導心肌組織內(nèi)HO-1表達上調(diào)，增強其酶活性，進而通過HO-1對DOX導致的心肌細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用。

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C-phycocyanin protects doxorubicin-induced myocardial cells injury by Nrf 2/heme oxygenase-1 pathway

LUO Xiang-yu, LUO Wei-minΔ, ZENG Xue-song, ZHANG Jun

(Department of Cardiothoracic Surgery，Hubei University of Medicine Affiliated Taihe hospital of Shiyan, Shiyan, 442000 China)

Objective To observe the role of heme oxygenase (HO)-1 on the protective effect of C-phycocyanin (CPC) on doxorubicin (DOX)-induced myocardial cells injury by Nvf2/HO-1 pathway.Methods60 SD rats were randomly divided into control group, DOX group, CPC group and tin protoporphyrin IX (SnPP, an inhibitor of HO-1) group,each had 15 rats. The control group was injected with normal saline injection，while the DOX group was administrated with doxorubicin by intraperitoneal injection in a cumulative dose of 15 mg/kg for two weeks. For the CPC rats, 20, 40 and 60 mg/kg of CPC was administrated. The level of creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH) were detected, and the activity of HO-1 and caspase-3 were also examined. Expression of HO-1 and activation of Nrf 2 were detected by Western blot.ResultsCompared with control group, serum levels of CK, LDH and Caspase-3 activity in DOX group were significantly increased（P＜0.05）, but HO-1 in cardiac muscle was only increased slightly. upregulation. Treatment with CPC could significantly ameliorated the CK, LDH and Caspase-3 activity, and markedly induce HO-1 expression and its activity. The reduction of CK, LDH and Caspase-3 activity by CPC could be reversed by treatment of the HO-1 inhibitor, SnPP. Furthermore, CPC sould also induce Nrf 2 activation.ConclusionThe protective effect of CPC on doxorubicin-induced myocardial cells in jury via Nrf 2 induced HO-1 HO-1 expression.

C-phycocyanin；Doxorubicin；heme oxygenase-1

R 453．9

A

1005-1678(2014)02-0030-04

阿霉素（Doxorubicin，DOX）是一種廣泛應用于腫瘤治療的蒽環(huán)類抗生素，是臨床上最有效的抗腫瘤藥物之一。盡管其對包括白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤具有抑制作用，但其蓄積性不可逆性心肌病以及充血性心衰限制了其使用[1]。DOX導致的毒性心肌病原因很多，其中活性氧（reactive oxygen species，ROS）、鈣超載以及線粒體損傷介導的心肌細胞凋亡是其重要機制[2]。近年來，某些藥用植物在DOX所致的心肌細胞損傷中發(fā)揮重要作用[3]，如上調(diào)血紅素氧合酶（Heme oxygenase-1，HO-1）的表達，從而發(fā)揮抗氧化、抗凋亡等作用。藻藍素（C-phycocyanin，CPC）一種從螺旋藻提取、加工而成的天然食用色素，是一種營養(yǎng)價值極高的營養(yǎng)物質(zhì)。并具有強大的抗氧化和清除自由基能力[4-5]。本課題組的前期研究結(jié)果顯示，CPC對DOX誘發(fā)的心臟毒性具有一定的保護作用，但其機制尚未明了。本研究旨在觀察HO-1在CPC心肌保護作用中的作用。

十堰市科技攻關項目（2009S48）

羅湘玉，女，副主任護師，研究方向：心肺疾病的防治研究，E-mail：xiangyu_luo@126.com；羅衛(wèi)民，通信作者,男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：胸心外科疾病的診斷與治療，E-mail:weiminluo@163.com。