蒽貝素聯(lián)合紫杉醇抑制肺癌A549細胞的增殖和荷瘤裸鼠腫瘤的生長研究

張春輝，孫平

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北武漢 430070）

蒽貝素聯(lián)合紫杉醇抑制肺癌A549細胞的增殖和荷瘤裸鼠腫瘤的生長研究

張春輝，孫平Δ

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北武漢 430070）

目的研究蒽貝素聯(lián)合紫杉醇對A 549細胞的增殖抑制作用和對肺癌異位瘤的生長抑制作用。方法采用MTT法研究蒽貝素聯(lián)合紫杉醇對A 549細胞的增值抑制作用。流式細胞術(shù)檢測蒽貝素聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)A 549細胞的凋亡率。構(gòu)建裸鼠A 549肺癌異位瘤模型，研究蒽貝素聯(lián)合紫杉醇對肺癌異位瘤的生長抑制作用。結(jié)果蒽貝素聯(lián)合紫杉醇對A 549細胞的增殖抑制作用顯著強于蒽貝素組和紫杉醇組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。細胞凋亡實驗結(jié)果顯示，蒽貝素聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)A 549細胞凋亡率分別是蒽貝素組和紫杉醇組的4．8倍和2．4倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。荷瘤裸鼠治療實驗結(jié)果顯示，蒽貝素聯(lián)合紫杉醇對肺癌的生長抑制作用顯著強于其他組（P＜0．01）。結(jié)論蒽貝素能夠聯(lián)合紫杉醇有效抑制A 549細胞的增殖及荷瘤裸鼠腫瘤的生長，是一種潛在的肺癌治療方法。

蒽貝素；紫杉醇；肺癌

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清購自浙江四季青生物科技有限公司；蒽貝素購自美國sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；MTT試劑盒購自sigma公司；紫杉醇購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；其余試劑為分析純。A549人源性肺癌細胞購自上海細胞研究所；雄性裸鼠購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物許可證號：SDDX 2013-08231。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將A549細胞置于含有100 mg/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，濕度為13.5%，溫度為37℃。待細胞匯合度為0.8～0.9時，用2.5 mg/L胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT實驗考察不同藥物干預(yù)對A549的增殖抑制作用 培養(yǎng)A549細胞接種于96孔板中，當(dāng)孔板中細胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時加入無菌過濾后的紫杉醇（3 μg/mL）、蒽貝素（8 μg/mL）、紫杉醇+蒽貝素(紫杉醇，3 μg/mL +蒽貝素8μg/mL)各20 μL。將孔板移入37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后取出，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入200 μL DMSO，37℃避光振搖15 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定各孔的光密度值（OD）。

1.2.3 蒽貝素聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)A549細胞凋亡實驗 為了檢測蒽貝素聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)A549細胞的凋亡的作用，本研究按“1.2.2”項下培養(yǎng)細胞并給藥，將A549細胞給藥孵育24 h，然后用冰PBS清洗細胞3次，F(xiàn)ITC/PI雙染，細胞避光放置15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡數(shù)量。

1.2.4 肺癌異位腫瘤模型的建立 A549細胞經(jīng)胰酶消化，離心后將其懸浮于DMEM培養(yǎng)液中，計數(shù)調(diào)節(jié)濃度至5×107個/mL。取4～6周齡，體重20～25 g的雄性裸鼠，將準(zhǔn)備好的A549細胞懸濁液皮下接種于裸鼠背部，每只裸鼠接種0.1 mL細胞懸濁液。接種后1～2周可見背部長出腫瘤塊，證明接種成功。將優(yōu)選后的24只荷瘤裸鼠隨機分成4組，生理鹽水組、紫杉醇干預(yù)組（10 mg/kg）、蒽貝素干預(yù)組（20 mg/kg）和紫杉醇+蒽貝素（紫杉醇，10 mg/kg+蒽貝素10 mg/kg）。各組均采用腹腔注射給藥，每2 d測量1次腫瘤大小。第21天處死小鼠，剖腫瘤、照相。

2 結(jié)果

2.1 蒽貝素增強紫杉醇對肺癌A549細胞的增殖抑制作用

MTT實驗結(jié)果顯示，紫杉醇和蒽貝素對A549細胞均有一定的增殖抑制作用。當(dāng)紫杉醇與蒽貝素聯(lián)合用藥時，對A549細胞的增殖具有更強的抑制作用，聯(lián)合用藥對A549細胞的抑制能力顯著強于單獨用藥，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01，見圖1）。

圖1 不同藥物干預(yù)組對A 549細胞增殖的影響

2.2 蒽貝素聯(lián)合紫杉醇促進肺癌A549細胞凋亡細胞凋亡的定量實驗結(jié)果表明，紫杉醇、蒽貝素和聯(lián)合給藥都能不同程度誘導(dǎo)肺癌細胞的凋亡。紫杉醇、蒽貝素和聯(lián)合給藥誘導(dǎo)A549細胞壞死和早期凋亡率分別為46.2%、25.4%和84.6%，而對照生理鹽水組早期凋亡率為0.68%（見圖2）。

圖2 不同藥物干預(yù)組對A 549細胞凋亡率的影響

2.4 蒽貝素聯(lián)合紫杉醇抑制荷瘤鼠腫瘤的生長 各干預(yù)組對荷瘤裸鼠的治療實驗結(jié)果表明：相比于生理鹽水組，紫杉醇組和蒽貝素組都能夠顯著抑制腫瘤的生長，荷瘤小鼠生長20 d后，生理鹽水組小鼠腫瘤體積分別增至給藥前腫瘤體積的2.42倍、蒽貝素干預(yù)組為2.18倍和紫杉醇干預(yù)組為1.55倍，而聯(lián)合干預(yù)組腫瘤體積僅增至原體積的1.21倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見圖 3）。

3 討論

紫杉醇是臨床常用的細胞毒類抗腫瘤藥物。蒽貝素是一種XIAP的小分子抑制劑，能夠通過抑制XIAP，進而誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。蒽貝素與其他化療藥物聯(lián)用能夠有效增強化療藥物對腫瘤細胞的抑制效果[13-15]。目前國內(nèi)外尚未見到蒽貝素與化療藥物聯(lián)合作用于肺癌的報道。

本研究將臨床上已經(jīng)證實的抗腫瘤藥物紫杉醇與蒽貝素聯(lián)合用于抑制肺癌A549細胞的研究，結(jié)果顯示紫杉醇與蒽貝素聯(lián)合使用能夠顯著抑制肺癌A549細胞的增殖。凋亡實驗結(jié)果顯示聯(lián)合用藥誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的能力顯著強于紫杉醇或者蒽貝素單獨給藥，這說明紫杉醇和蒽貝素聯(lián)合給藥能夠?qū)δ[瘤細胞凋亡起到協(xié)同促進作用。此外，本研究還通過體內(nèi)腫瘤異位模型考察了聯(lián)合給藥對腫瘤生長的抑制能力，結(jié)果與體外研究結(jié)果相一致。綜上所述，紫杉醇和蒽貝素聯(lián)合使用能夠有效抑制肺癌的發(fā)展，是一種潛在的肺癌治療手段。對于蒽貝素抑制腫瘤的機制可能與其阻斷腫瘤細胞β-catenin信號途徑，下調(diào)β-catenin核表達，上調(diào)其胞膜表達有關(guān)[14]。目前還在進一步的研究中。

圖3 不同藥物干預(yù)組對肺癌移植瘤的抑制率

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Inhibitation of embelin and paclitaxel on lung cancer A549 cell proliferation
and tumor growing in tumor-bearing nude mice

ZHANG Chun-hui，SUN PingΔ

(Hospital of Central China Agricultural University, Wuhan 430070, China)

ObjectiveTo evaluate the effect of embelin combined with paclitaxel on the inhibition of A549 lung cancer cell proliferation and tumor growing in tumor bearing nude mice.MethodsThe anti-proliferation efficiency of embelin combined with paclitaxel were evaluated by MTT assay, and A549 cell apoptosis were evaluated by flow cytometry. A549 cells were xenografted in mice to establish the animal model, which were used to evaluate the effect of anti-tumor.Resultscompared to saline group、embelin group and paclitaxel group, the (paclitaxel + embelin) group could inhibit the growth of A549 cells effectively(P＜0.05). The embelin combined with paclitaxel induced the apoptosis of A549 cells more effective than paclitaxel alone. The (paclitaxel + embelin) group significantly inhibited the growth of tumor tissue.Conclusionthe paclitaxel can inhibit the growth of A549 cells, the embelin can induce the apoptosis of A549 cells, and the combination of paclitaxel and embelin may be a potentially effective treatment for lung cancer.

embelin;paclitaxel;lung cancer

R 734．2

A

1005-1678(2014)02-0007-03

肺癌作為嚴重威脅人類健康的頭號惡性腫瘤，國內(nèi)每年新發(fā)肺癌約50萬，到2025年預(yù)計我國每年將有100萬肺癌患者[1]。肺癌的治療以手術(shù)為主，聯(lián)合化療為輔。紫杉醇是來源于紅豆杉屬太平紫杉的一種細胞毒性物質(zhì)，被廣泛用于乳腺癌[2]、卵巢癌[3]、肝癌[4]和非小細胞肺癌的治療[5]。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)是近年來備受矚目的一類蛋白質(zhì)家族，是一類獨立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。某些IAPs成員異常高表達常引起細胞凋亡受阻，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitorof apoptosis protein，XIAP)是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑[9]。X連鎖凋亡抑制蛋白是腫瘤細胞內(nèi)抑制凋亡發(fā)生的重要蛋白之一。蒽貝素是一種XIAP的小分子抑制劑，能夠通過抑制XIAP，進而誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡[10-12]。本研究擬探討蒽貝素聯(lián)合紫杉醇對肺癌A549細胞增殖的影響以及對荷瘤小鼠腫瘤的治療效果，為臨床治療提供更多的實驗依據(jù)。

國家自然科學(xué)基金（81171365）

張春輝，女，本科，醫(yī)師，研究方向：肺癌的基礎(chǔ)與臨床治療研究，E-mail：zhc297167698@163.com；孫平,通信作者，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：肺癌的基礎(chǔ)與臨床治療研究，E-mail：2094252562@qq.com。