青蒿琥酯對實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用*

張新欣 李曉麗 莊 珊 劉 深 李秀華 李衍濱△

(1濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東 濰坊 261053；2山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014；3山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250014)

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)主要由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor，AChR)介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與的自身免疫性疾病[1]。大量高親和力AChR抗體與神經(jīng)肌肉突觸后膜上的AChR結(jié)合后通過激活補(bǔ)體而導(dǎo)致AChR的破壞或消失[2]。臨床上表現(xiàn)為晨輕暮重，活動后加重、休息后減輕的骨骼肌無力現(xiàn)象。本文通過建立實驗性自身免疫性重癥肌無力動物模型(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)，探討青蒿琥酯對實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠TNF-α、IgG2a、IgG2b的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雌性Lewis大鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)。

1.1.2主要試劑 抗原系人工合成的大鼠來源的AChR α亞基97-116 肽段，肽序列 DGDFAIVKFT-KVLLDYTGHI(西安聯(lián)美生物科技有限公司)；青蒿琥酯(廣西桂林藥業(yè)股份有限公司)；H37Ra結(jié)核桿菌(美國 Difco公司)；RPMI 1640(北京HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；生物素標(biāo)記兔抗大IgG、HRP標(biāo)記的鏈霉親和素(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1EAMG模型的誘導(dǎo)[3]和臨床評分 將人工合成的大鼠來源的AChR α亞基肽段溶于滅活結(jié)核桿菌和不完全弗氏佐劑(incomplete freund's adjuvant，IFA)中，于每只大鼠每側(cè)后足墊皮下分別注射100 μl抗原乳液。第1次接種11d后再次強(qiáng)化免疫。首次免疫的當(dāng)天標(biāo)記為0d。采用雙盲隔日稱體重并觀察大鼠癥狀。用Lennon臨床評分測量肌力。

1.2.2分組與治療 將15只大鼠隨機(jī)分為青蒿琥酯大劑量組(100 mg/kg)、小劑量組(10 mg/kg)和對照組(生理鹽水)。于免疫后第10天，即EAMG大鼠發(fā)病初期，每日給予灌胃治療，直至大鼠發(fā)病高峰期第43天。

1.2.3淋巴結(jié)MNC懸液的制備 無菌條件下，取腹股溝淋巴結(jié)，放入盛有2ml RPMI1640培養(yǎng)基的離心管中；將離心管中的淋巴結(jié)倒至培養(yǎng)皿中的細(xì)胞濾器中，加入2ml RPMI1640后用無菌針?biāo)ㄟM(jìn)行研磨，制備淋巴結(jié)MNC懸液。

1.2.4流式檢測淋巴結(jié)MNC中TNF-α+淋巴細(xì)胞的百分比 每管取1×106個淋巴結(jié)MNC，加入含0.5%BSA的PBS洗滌細(xì)胞，離心后棄上清并混勻；加入2%甲醛固定，離心，加入含0.5%BSA的PBS洗滌細(xì)胞，離心后棄上清并混勻，加入0.5%皂甙室溫下避光20 min，洗滌細(xì)胞后，加入FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠TNF-α抗體，孵育后加入含0.5% BSA的PBS洗滌細(xì)胞；離心、重懸、過濾后上機(jī)。

1.2.5ELISA法檢測EAMG大鼠血清中抗R97-116 IgG2a、IgG2b抗體 用ELISA法測不同組大鼠血清中抗R97-116抗體的含量。將 R97-116肽溶于包被液中，加入96孔板中，4℃過夜；棄包被液，用含0.05%的Tween 20洗板；然后加入含10% FBS的封閉液200 μl /孔，室溫1.5 h；棄液；加入稀釋血清，室溫2 h；洗板后兔抗大鼠IgG；洗板，加入TMB顯色；然后加入終止液，酶標(biāo)儀快速讀數(shù)，結(jié)果以光密度值(OD值)表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17. 0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯對TNF-α+淋巴細(xì)胞百分比的影響

大劑量組和小劑量組TNF-α+淋巴細(xì)胞的百分比分別為(4.87 ± 1.5)%和(3.03 ± 0.35)%，對照組TNF-α+淋巴細(xì)胞的百分比為(4.9 ± 0.31)%，與對照組相比，青蒿琥酯小劑量治療組明顯下調(diào)了TNF-α+細(xì)胞的數(shù)量(P=0.046)，青蒿琥酯大劑量組TNF-α細(xì)胞的數(shù)量有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.901)。(圖1)

2.2 青蒿琥酯對EAMG大鼠血清R97-116 IgG2a水平的影響

與對照組相比，青蒿琥酯兩治療組中血清IgG2a抗體水平明顯下降(P<0.05)，并且小劑量組血清IgG2a抗體下降趨勢較大劑量組顯著(P=0.044)，說明青蒿琥酯可以降低血清中抗R97-116 IgG2a抗體水平。在兩組中，小劑量組R97-116 IgG2a抗體量下降的幅度更明顯。(見表2，圖2)

＊P< 0.05

＊P< 0.05，＊＊P< 0.01

圖2 青蒿琥酯對血清中抗R97-116 IgG2a抗體水平的影響

2.3 青蒿琥酯對EAMG大鼠血清中R97-116 IgG2b水平的影響

與對照組相比，青蒿琥酯兩治療組中血清IgG2b抗體水平明顯下降(P<0.05)，且在兩治療組中，小劑量組IgG2b抗體水平下降幅度更加顯著(P<0.0001)。說明青蒿琥酯可以降低血清中抗R97-116 IgG2b抗體水平，10 mg/kg青蒿琥酯小劑量治療組中R97-116 IgG2b抗體量下降幅度更明顯。(見表3，圖3)

表3 各組R97-116 IgG2b抗體水平的比較

＊＊P<0.01，＊＊＊P<0.001

圖3 青蒿琥酯對血清中抗R97-116 IgG2b抗體水平的影響

3 討論

本文結(jié)果顯示，與對照組和大劑量組相比，小劑量組青蒿琥酯能夠明顯降低TNF-α+細(xì)胞的數(shù)量，抑制 TNF-α的表達(dá)和分泌，從而誘導(dǎo)免疫耐受或延遲免疫應(yīng)答，與此同時，小劑量組中EAMG大鼠血清抗R97-116 IgG2a和IgG2b的水平也是顯著降低的，以上可以證明，小劑量的青蒿琥酯能夠通過免疫調(diào)節(jié)作用改善EAMG大鼠的病情。

青蒿琥酯是具有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物青蒿素的水溶性衍生物，現(xiàn)在臨床上主要用于瘧疾的治療[4]。近些年來，人們研究發(fā)現(xiàn)，在一些自身免疫性疾病中，青蒿素及其衍生物有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。它們能夠抑制B淋巴細(xì)胞的增殖及相關(guān)自身免疫性抗體的產(chǎn)生。青蒿琥酯對實驗性系統(tǒng)性紅斑狼瘡有顯著的治療作用，它可以抑制B淋巴細(xì)胞的增殖、分化來減少anti-dsDNA抗體的產(chǎn)生，下調(diào)血清中單核趨化蛋白-1(MCP-1)的水平，減少TNF-α的表達(dá)[5]。另外，在膿毒血癥的小鼠中，青蒿琥酯能夠通過抑制TLR4和TLR9信使RNA的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活減少炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放[6]。

細(xì)胞因子TNF-α在許多自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用，例如濕性關(guān)節(jié)炎[7]、狼瘡性腎炎[8]、敗血癥性休克[9]等。TNF-α可以通過 IL-2 / IL-2R通路，上調(diào) IL-2Rα刺激T細(xì)胞增殖，促進(jìn)體內(nèi)的免疫應(yīng)答的發(fā)生。而在MG的發(fā)病機(jī)制中TNF-α也起著極為重要的作用。Wang等發(fā)現(xiàn)，給予大鼠IFN-γ后能夠加重EAMG的癥狀，這與增加TNF-α應(yīng)答及抗AChR抗體水平及有關(guān)[10]。MG患者血清TNF-α水平明顯高于正常人，膽堿酯酶抑制劑、激素治療或胸腺手術(shù)后血清TNF-α水平下降，患者的肌無力癥狀也得到了一定程度的改善?？筎NF-α抗體治療可緩解AChR誘導(dǎo)的 EAMG大鼠病情[11]。近年來臨床上用抗TNF-α抗體治療MG患者取得顯著療效可進(jìn)一步證實這一觀點。促炎因子在EAMG的發(fā)生和發(fā)展中，并不是獨自發(fā)揮作用，而是相互促進(jìn)協(xié)調(diào)進(jìn)行的。TNF-α也是這樣的，它的產(chǎn)生可以促進(jìn)IL-1、IL-12等細(xì)胞因子的分泌，繼而活化Th1細(xì)胞。在小鼠EAMG模型中，Th1細(xì)胞起著重要的致病作用，因為它們能夠刺激抗AChR抗體的產(chǎn)生并引起神經(jīng)肌肉接頭功能的失調(diào)[12]。有研究表明，Th1型細(xì)胞通過分泌TNF-α等細(xì)胞因子促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG2，血清中的IgG2可以高效的與神經(jīng)肌肉接頭處突出后膜上的AChR結(jié)合并激活補(bǔ)體最終導(dǎo)致肌無力的發(fā)生與發(fā)展[13]。本文結(jié)果顯示，與對照組和大劑量組相比，小劑量青蒿琥酯治療組明顯抑制了TNF-α的生成與分泌，顯著降低了血清中IgG2a、IgG2b的水平，這也可以證明，小劑量青蒿琥酯可以通過抑制細(xì)胞因子TNF-α的分泌來降低IgG2a、IgG2b的產(chǎn)生，從而緩解EAMG大鼠病情。

乙酰膽堿是骨骼肌收縮所必需的一種神經(jīng)遞質(zhì)，與AChR結(jié)合后才起生物作用。重癥肌無力患者的AChR的破壞與患者體內(nèi)存在AChR-Ab有關(guān)。因此測定AChR-Ab是診斷和判斷預(yù)后有關(guān)。有人研究發(fā)現(xiàn)幾乎85%～90%以全身癥狀為主的MG 患者血清中可檢測到AChR-Ab[14]。AChR-Ab被認(rèn)為是MG的主要致病因子，是介導(dǎo)MG發(fā)生的關(guān)鍵因素。MG患者的AChR-Ab主要是IgG型，以IgGl、IgG2、IgG3為主，其他亞型抗體少見。我們在實驗中檢測了與AChR具有較高結(jié)合能力的IgG2a、IgG2b來反應(yīng)EAMG大鼠的預(yù)后。與對照組相比，青蒿琥酯治療組能夠明顯緩解EAMG大鼠的癥狀，與最終降低的抗R97-116 IgG2a和IgG2b抗體水平密切相關(guān)，而且兩治療組相比較，小劑量組青蒿琥酯的療效明顯優(yōu)于大劑量組。

本文結(jié)果表明，小劑量青蒿琥酯可以明顯緩解EAMG大鼠的癥狀，與最終降低的抗R97-116 IgG2a和IgG2b抗體水平密切相關(guān)，且這種作用可能是通過減少TNF-α的合成與分泌來抑制B細(xì)胞的活化實現(xiàn)的?？傊┝壳噍镧AMG有顯著的治療作用，將為MG的臨床治療提供新的策略和方法。

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