Survivin蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義

劉莉霞，李術(shù)平，何秀萍

（牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江 牡丹江157011）

卵巢癌是婦科常見(jiàn)惡性腫瘤之一，目前在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率及病死率逐年升高。卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是由于多種基因出現(xiàn)了異常改變，并且這種改變的結(jié)果被逐漸累積起來(lái)，如原癌基因被異常激活、細(xì)胞的促凋亡基因與抗凋亡基因間功能失衡。卵巢癌發(fā)生原因的復(fù)雜性，卵巢癌術(shù)后易復(fù)發(fā)以及卵巢癌患者對(duì)化療藥物不敏感性均可能導(dǎo)致卵巢癌治療失敗，患者病死率高。Survivin是剛被研究發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白，是現(xiàn)今為止發(fā)現(xiàn)的分子質(zhì)量最小但抗凋亡作用卻是最強(qiáng)的蛋白，其具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂和抑制細(xì)胞凋亡的功能［1］。Survivin在血管形成以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起一定作用，Survivin抑制細(xì)胞凋亡的功能與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥密切相關(guān)。在多步驟腫瘤發(fā)生的早期，各種因素導(dǎo)致的凋亡抑制不僅有利于細(xì)胞的繼續(xù)增殖，還有利于異常基因的進(jìn)一步積聚，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，從而有助于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

卵巢癌的發(fā)生是一個(gè)繁瑣的過(guò)程，因而探討凋亡抑制基因在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)，及其與卵巢癌化療耐藥間的關(guān)系具有重要意義。有關(guān)Survivin蛋白在卵巢癌中的表達(dá)以及在化療耐藥中作用的研究目前鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬采用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化法檢測(cè)卵巢癌組織中Survivin蛋白的表達(dá)，分析其在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo)本資料

于2010-02～2011-06搜集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科手術(shù)治療并有良好隨訪條件的患者。取正常卵巢20例，良性卵巢組織30例，卵巢癌27例，其中卵巢漿液性囊腺癌20例，卵巢黏液性囊腺癌5例，其它類型2例。按WHO分類標(biāo)準(zhǔn)，包括高分化6例，中低分化21例。根據(jù)2000年FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期+Ⅱ期7例，Ⅲ期+Ⅳ期20例。按年齡分類，其中≤50歲的患者10例，＞50歲的患者17例。搜集11例絕經(jīng)前的患者，16例絕經(jīng)后的患者。無(wú)腹水形成的患者18例，有腹水形成的患者9例。

1.1.2 主要試劑

兔抗人Survivin抗體，購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。組織芯片由陜西艾莉娜生物科技有限公司制作。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化方法

（1）將切好的組織芯片置于電熱恒溫干燥箱中30min。

（2）組織芯片切片常規(guī)脫蠟至水，PBS液浸泡5min，蒸餾水沖洗。將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，微波修復(fù)15min，涼至室溫，3%過(guò)氧化氫溶液泡20min，PBS浸泡，滴入正常山羊血清封閉液半小時(shí)，加Survivin抗體4℃過(guò)夜，滴加標(biāo)記二抗，放入濕盒，水浴30min，PBS液沖洗3次，DAB顯色，鏡下觀察3～5min，陽(yáng)性者出現(xiàn)棕黃色顆粒。流水沖洗后蘇木復(fù)染，脫水，中性樹(shù)膠封片。

1.2.2 免疫組化陽(yáng)性結(jié)果判定

Survivin蛋白染色主要定位于腫瘤的細(xì)胞核，陽(yáng)性表達(dá)為突出于背景的棕黃色或棕褐色顆粒且境界較清晰，隨即觀察10個(gè)高倍視野下的細(xì)胞數(shù)，每個(gè)視野下各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)其中陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)的比率，可分為以下4級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為（-）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～25%為（±）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%為（+）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)50%～75%為（++）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%為+++）。

1.2.3 化療耐藥判斷

化療耐藥判斷：術(shù)后一周內(nèi)，患者接受正規(guī)化療。每個(gè)療程開(kāi)始前均行常規(guī)檢查。依據(jù)化療療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)［2］：（1）化療敏感性卵巢癌：在化療早期就獲得完全緩解，并且停藥半年以上也未復(fù)發(fā)；（2）耐藥性卵巢癌：早期療效雖然達(dá)到完全緩解 ，但半年內(nèi)便出現(xiàn)腫塊、CA125逐漸升高、腸梗阻的發(fā)生、胸水腹水等；（3）持續(xù)性卵巢癌：在化療早期雖有反應(yīng)，但檢查發(fā)現(xiàn)殘余病灶體積增大25%；（4）難治性卵巢癌：化療藥物對(duì)腫瘤無(wú)效果。我們將第1項(xiàng)歸為化療敏感，后3項(xiàng)歸為化療耐藥，這樣實(shí)驗(yàn)中患者分為化療敏感組和化療耐藥組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用卡方檢驗(yàn)及Fisher法進(jìn)行陽(yáng)性率比較，以P＜0.05為差別顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片結(jié)果

組織芯片合格的標(biāo)準(zhǔn)為非目標(biāo)組織點(diǎn)數(shù)+組織脫點(diǎn)數(shù)≤5%。卵巢癌組織芯片進(jìn)行切片HE染色，結(jié)果顯示組織芯整齊排列無(wú)脫落。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

2.2.1 Survivin蛋白在卵巢組織中的表達(dá)

圖1為Survivin蛋白在卵巢癌組織中的染色結(jié)果，Survivin蛋白在正常卵巢組織中不表達(dá)，兩兩比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 Survivin蛋白在卵巢組織中的表達(dá)情況

圖1 Survivin在卵巢癌中的表達(dá)（×400）

2.2.2 Survivin蛋白的表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

Survivin蛋白在卵巢癌中的陽(yáng)性表達(dá)率隨著臨床分期的進(jìn)展而升高（P＜0.05）；而與卵巢癌的組織類型、病理分級(jí)、患者年齡、是否絕經(jīng)及有無(wú)腹水形成無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 Survivin蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2.3 Survivin蛋白與化療耐藥的關(guān)系

27例卵巢癌有化療隨訪價(jià)值的19例，其中10例化療有效，取得臨床緩解，9例耐藥。化療有效組中Survivin蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率為50%（5／10），耐藥組中Survivin蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率為100% （9／9），分析顯示耐藥組Survivin蛋白的陽(yáng)性率顯著高于有效組（P＜0.05）。

3 討論

組織芯片（tissue chip）又稱組織微陣列（tissue microaray，TMA），1998年由 Kononen等［3］首次提出這一概念。組織芯片技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)［4］：①小體積，高通量；②大樣本，高效率；③誤差小，結(jié)果可靠；④用途廣，簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)；⑤微型化及自動(dòng)化；⑥可與免疫組織化學(xué)法、原位雜交等許多分子病理檢測(cè)方法相結(jié)合，進(jìn)行檢測(cè)DNA、RNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。組織芯片技術(shù)可為腫瘤的早期診斷篩選分子標(biāo)志物，并為腫瘤患者的療效判斷和預(yù)后提供重要的依據(jù)。

Survivin是一種凋亡抑制蛋白，是現(xiàn)今為止發(fā)現(xiàn)的分子質(zhì)量最小但抗凋亡作用卻是最強(qiáng)的蛋白。Survivin抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要是借助于天冬氨酸特異性氨酸酶（Caspase）的幫助，通過(guò)抑制Caspase一3、Caspase-7等下游的凋亡因子而發(fā)揮其抗凋亡作用。并有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［5］高表達(dá)的Survivin還可借助與有絲分裂紡錘體的連接，作用于細(xì)胞周期G2／M期，并抑制多種凋亡因子對(duì)細(xì)胞周期G2／M期的凋亡誘導(dǎo)作用，從而加快細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)換，最后細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖而發(fā)生惡性變。

本研究主要運(yùn)用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化法檢測(cè)Survivin蛋白在卵巢組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin蛋白在正常卵巢組織中不表達(dá)，在卵巢良性腫瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率為23.3%（7／30），在卵巢上皮性癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為81.5%（22／27），兩兩比較差異有顯著意義 （P＜0.05）。Survivin蛋白在卵巢組織中主要表達(dá)于細(xì)胞核。有研究發(fā)現(xiàn)Survivin蛋白因有Survivin-△Ex3和Survivin-2B兩個(gè)不同的剪接異構(gòu)體，所以Survivin蛋白可定位于細(xì)胞核也可定位于細(xì)胞漿，但表達(dá)部位的不同決定了其不同的生物學(xué)功能［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin蛋白在Ⅰ+Ⅱ期陽(yáng)性表達(dá)率為42.9%（3／7），Ⅲ+Ⅳ期陽(yáng)性表達(dá)率為95%（19／20），可得出隨著臨床分期越高Survivin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)越高（P＜0.05）；Survivin蛋白在中低分化組中陽(yáng)性表達(dá)率高于高分化組，但兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在卵巢良性囊腺瘤中Survivin蛋白低表達(dá)甚至不表達(dá)，而在卵巢癌中Survivin蛋白高表達(dá)于細(xì)胞漿或細(xì)胞核，并且Survivin蛋白與卵巢癌的組織學(xué)類型、臨床分期、患者遠(yuǎn)期存活情況等有重要關(guān)系［7］。這說(shuō)明Survivin與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，推測(cè)凋亡抑制基因Survivin顯著抑制了卵巢癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展，可成為卵巢癌早期分子診斷及預(yù)后不良的重要指標(biāo)之一。并且在腫瘤中Survivin基因擴(kuò)增、突變、甲基化、啟動(dòng)子活性增強(qiáng)等許多機(jī)制可以使Survivin表達(dá)失調(diào)。其中Survivin的突變體p Ad-T34A可使Survivin失去活性，其機(jī)制為Survivin基因的34位蘇氨酸被不能磷酸化的丙氨酸代替，將p Ad-T34A導(dǎo)入乳腺癌后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素C釋放，并且Caspase-3被激活發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［8］。因此抑制Survivin蛋白的表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，為腫瘤治療提供新方法。

癌細(xì)胞的凋亡是多種化療藥物發(fā)揮作用的一個(gè)共同目的，能耐受化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的癌細(xì)胞最終形成了對(duì)藥物的耐藥。Survivin可直接抑制Caspase-3，Caspase-7的活性而抑制細(xì)胞凋亡，并可直接與有絲分裂的微管蛋白結(jié)合使得細(xì)胞在分裂期對(duì)紫杉醇無(wú)反應(yīng)，使化療藥物功能喪失，從而拮抗化療藥物消滅癌細(xì)胞的作用，還有研究表明Survivin還可通過(guò)與磷脂酰肌醇3激酶（P13K）／Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的相互作用而發(fā)揮其耐藥作用［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Survivin在化療耐藥組中高表達(dá)，在化療敏感組中低表達(dá)。Survivin蛋白促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，可能是導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生耐藥的原因之一，因此將Survivin作為靶點(diǎn)的分子治療將成為卵巢癌逆轉(zhuǎn)化療耐藥的新方法。

目前卵巢癌的發(fā)病率及病死率逐年增高，因此探索卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及化療耐藥已成為目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)得出凋亡抑制基因Survivin與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展及化療耐藥密切相關(guān)。

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