DQA1基因啟動子區(qū)及編碼區(qū)與大動脈炎的關聯(lián)研究

呂納強 黨愛民 鄭德裕 劉國仗

臨床研究

DQA1基因啟動子區(qū)及編碼區(qū)與大動脈炎的關聯(lián)研究

呂納強 黨愛民 鄭德裕 劉國仗

作者單位：100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院阜外心血管病醫(yī)院特需醫(yī)療中心

目的 大動脈炎（Takayasu arteritis）是一種累及主動脈及其主要分支的慢性進行性非特異血管炎性疾病。本研究以人類白細胞抗原（HLA）-DQA1為候選基因分析其編碼區(qū)基因型和啟動子區(qū)多態(tài)性與中國大動脈炎的關聯(lián)。方法 采用病例對照研究的方法，入選中國漢族大動脈炎患者100例和健康對照104例，應用聚合酶鏈反應-序列特異性引物（PCR-SSP）和聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性分析（PCR-SSCP）方法檢測HLA-DQA1基因編碼區(qū)和啟動子區(qū)基因型，并分析基因型與疾病的關聯(lián)。結果 具有類似DQα鏈蛋白抗原結合槽部位肽結合袋的氨基酸組成結構的DQA1*0301/2/3基因型，在大動脈炎組顯著低于對照組（P=0.003）。DQA1啟動子QAP 1.3在大動脈炎組低于對照組（P=0.036）。結論 DQA1*0301/2/3基因型、DQA1啟動子QAP 1.3基因型可能是大動脈炎的保護基因型。

大動脈炎； DQA1等位基因； HLA基因

大動脈炎（Takayasu arteritis）是累及主動脈及其主要分支的慢性進行性非特性血管炎性疾病。炎癥損害中層動脈壁，致大動脈狹窄、擴張或動脈瘤形成[1-3]。大動脈炎在我國并不罕見，1962年阜外醫(yī)院在國際上首先提出縮窄性大動脈炎的概念，此后發(fā)現(xiàn)了大量的臨床病例[4,5]。大動脈炎的病因及發(fā)病機制尚不清楚，目前認為大動脈炎發(fā)病與人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因密切相關[6]。

在大動脈炎與HLA基因的關聯(lián)研究中，不同種族人群報道的易感基因型不同。日本的Dong等[7]對64例日本患者的研究發(fā)現(xiàn)，DQA1*0103在患者中頻率顯著升高，DQA1*0301在患者中頻率顯著低于正常對照。Khraishi等在北美的人群中未發(fā)現(xiàn)易感基因。Girona等在墨西哥患者中發(fā)現(xiàn)易感基因型是DRB1*1301。中國大動脈炎患者與HLA-Ⅱ類基因相關性結果最早見于2000年黨愛民等[8]對84例患者的研究，發(fā)現(xiàn)DRB1*04、DRB1*07與大動脈炎易感相關。此后肖占祥等對44例患者研究后發(fā)現(xiàn)DQA1*0301頻率顯著低于正常對照。從上述研究結果可知，對于HLA-Ⅱ類基因，在不同人群中的結論差異較大，可能與種族的差異有關，也可能部分研究例數(shù)較少，難以揭示易感基因型。此外，基因啟動子的變異可能也參與疾病的發(fā)生、發(fā)展?；谏鲜鲅芯拷Y果，同時為進一步揭示大動脈炎發(fā)病與HLA-DQA1類基因的關聯(lián)，本研究擴大樣本量分析了中國漢族HLA-DQA1基因編碼區(qū)與大動脈炎的關聯(lián)，并首次篩查了大動脈炎患者DQA1啟動子區(qū)的多態(tài)性及與疾病的關聯(lián)，以期探索大動脈炎的遺傳易感基因型。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究采用病例對照設計，入選漢族大動脈炎患者100例，無血緣關系。大動脈炎患者來自于阜外心血管病醫(yī)院。大動脈炎診斷采用1990年美國風濕協(xié)會標準。健康對照組入選104例。對照組入選標準：無高血壓、自身免疫性疾病、糖尿病、遺傳性結締組織疾病、自身免疫性疾病家族史的健康體檢者。入選者均簽署知情同意書。本研究得到阜外心血管病醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 HLA-DQA1基因編碼區(qū)PCR-SSP法分型 抽取入選患者及對照組人群靜脈血4 ml，用EDTANa2抗凝保存，采用飽和氯化鈉氯仿法提取外周血基因組DNA。根據(jù)Olerup等[9]設計11對SSP引物采用聚合酶鏈反應-序列特異性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP） 進行HLA-DQA1基因分型，根據(jù)HLA-DQA1基因外顯子3的217位SNP C/A設計PCR-SSP引物將DQA1*0301和DQA1*0302/3進行區(qū)分。

1.3 HLA-DQA1基因啟動子區(qū)PCR-SSCP法分型采用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性分析（polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）方法對 HLA-DQA1基因啟動子區(qū)進行篩查及分型，純合子SSCP帶型為1條或2條，雜合子帶型為3條或4條。以純合子SSCP帶型為基礎與雜合子比對，測序驗證。從NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站上的 dMHC 數(shù)據(jù)庫中查找不同HLA-DQ基因的等位基因序列及相對應的特異性氨基酸序列。與文獻序列比對后，8種帶型的QAP等位基因根據(jù)相似的序列依次分別命名為 QAP4.1、QAP1.4、QAP2.1、QAP3.12、QAP4.2、QAP1.2、QAP1.3 和 QAP3.11。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 16.0軟件包分析數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用±s進行統(tǒng)計描述，2×2表卡方檢驗或Fisher精確概率法分析組間等位基因頻率、基因型頻率和單倍型頻率，計算P值、OR值及95%CI。多元Logistic回歸分析調整混雜因素的影響。采用雙側統(tǒng)計學顯著性檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 入選大動脈炎患者臨床資料 入選大動脈炎患者100例，其中男性26例，女性74例，男女比例為 1∶2.85，平均年齡（33.08±12.17）歲。對照組均為漢族，其中男性30名，女性74名，男女比例為1∶2.47，平均年齡（34.82±9.67）歲。入選大動脈炎組患者與健康對照組兩組間性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 HLA-DQA1編碼區(qū)等位基因頻率分布分析在HLA-DQA1編碼區(qū)等位基因DQA1*0302/3的頻率大動脈炎組顯著低于對照組（12.50%比20.19%，P=0.036，OR=0.565，95%CI 0.330～0.968），余等位基因大動脈炎組與對照組未見明顯差異。見表1。

2.3 HLA-DQA1啟動子區(qū)等位基因頻率分析 在HLA-DQA1啟動子區(qū)，QAP1.3在大動脈炎組顯著低于對照組 （5.00%比 10.58%，P=0.036，OR=0.445，95%CI 0.205～0.965），余等位基因大動脈炎組與對照組未見明顯差異。見表2。

2.4 大動脈炎患者發(fā)病與HLA-DQA1基因Logistic回歸分析 調整年齡、性別，對HLA-DQA1基因型與大動脈炎發(fā)病進行Logistic逐步回歸分析，結果顯示，具有類似DQα鏈蛋白抗原結合槽部位肽結合袋的氨基酸組成結構的DQA1*0301/2/3基因型，大動脈炎組顯著低于對照組（P=0.003）。

3 討論

大動脈炎是累及大動脈的炎癥性疾病，多見于主動脈弓及其主要分支，亦可累及肺動脈、冠狀動脈，受累的血管表現(xiàn)為全層動脈炎。其病因迄今尚不明確，一般認為是自身免疫因素和遺傳背景共同參與導致的自身免疫性疾病[1-3,6，10]。

表1 HLA-DQA1編碼區(qū)等位基因頻率分布［例數(shù)及百分率（%）］

表2 HLA-DQA1啟動子區(qū)等位基因頻率分布［例數(shù)及百分率（%）］

HLA-DQA1分子是由HLA-DQA1基因編碼的α鏈和β鏈互補形成的異二聚體，基因的多態(tài)性主要體現(xiàn)于胞外區(qū)結構域α1和β1形成的抗原結合槽部位。HLA-DQA1等位基因編碼的DQα鏈蛋白，它遞呈外來抗原給CD4+T細胞，不同等位基因編碼結構不同，從而影響結合抗原肽的種類和親和力，使免疫應答的效率不同。NCBI網(wǎng)站DQA1編碼區(qū)10個等位基因編碼的氨基酸序列比對結果顯示，全長246個氨基酸的DQα鏈蛋白中41個氨基酸存在顯著差異，HLA-DQA1基因外顯子多態(tài)性決定了抗原結合槽部位肽結合袋的多樣性。

在既往的研究中，Dong等[7]對64例日本患者的研究發(fā)現(xiàn)，DQA1*0103在患者中頻率顯著升高，DQA1*0301在患者中頻率顯著低于正常對照。國內肖占祥等對44例漢族患者研究后也發(fā)現(xiàn)，DQA1*0301頻率顯著低于正常對照。本研究共入選了100例大動脈炎患者，研究結果未發(fā)現(xiàn)與大動脈炎發(fā)病關聯(lián)的HLA-DQA1易感基因；DQA1*0301等位基因型頻率在大動脈炎組低于對照組（7.0%比10.1%），差異無統(tǒng)計學意義；而DQA1*0302/3在大動脈炎組顯著低于對照組（12.50%比20.19%，P=0.036，OR=0.565，95%CI 0.330～0.968）。 通 過 對DQα鏈蛋白抗原結合槽部位肽結合袋的氨基酸組成分析，在HLA-DQA1最具多態(tài)性的第二外顯子的主要抗原結合槽，DQA1*0301與DQA1*0302/3具有相同的氨基酸組成，推測這一結構可能減少大動脈炎的發(fā)病。將DQA1*0301、DQA1*0302/3二者合并采用Logistic逐步回歸模型分析，大動脈炎組頻率顯著低于對照組（P=0.003），Bonferroni校正后差異仍有統(tǒng)計學意義，結果進一步支持了上述推測。

基因啟動子區(qū)的多態(tài)性影響表達效率。本研究首次篩查了大動脈炎患者HLA-DQA1啟動子區(qū)的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了至少8種基因型，其中3型包含缺失的變異。體外研究[11]均表明，HLA-DQA1啟動子多態(tài)性可影響其分子的表達，轉錄活性QAP 3.11＞QAP 1.1＞QAP 4.2。此外，QAP2.1調控的分子表達水平也顯著高于QAP4。本研究未發(fā)現(xiàn)與大動脈炎遺傳易感相關的多態(tài)性；HLA-DQA1啟動子區(qū)QAP1.3在大動脈炎組低于對照組（5.00%比10.58%，P=0.036，OR=0.445，95%CI 0.205～0.965），HLA基因啟動子區(qū)多態(tài)性在大動脈炎中的作用尚需進一步研究探討。

本研究通過檢測中國漢族大動脈炎患者HLADQA1基因編碼區(qū)及篩查DQA1啟動子區(qū)的多態(tài)性，初步結果發(fā)現(xiàn)DQA1*0301/2/3基因型、DQA1啟動子QAP 1.3基因型是大動脈炎的保護基因型。未來更多的HLA基因與大動脈炎的研究結果將有助于解釋HLA基因在大動脈炎發(fā)病中的作用。

［1］Keser G，Direskeneli H，Aksu K.Management of Takayasu arteritis：a systematic review.Rheumatology（Oxford），2014，53：793-801.

［2］Vaideeswar P，Deshpande JR.Pathology of Takayasu arteritis：A brief review.Ann Pediatric Cardiol，2013，6：52-58.

［3］Numano F，Okawara M，Inomata H，et al.Takayasu’s arteritis.Lancet，2000，356：1023-1025.

［4］Zheng D，F(xiàn)an D，Liu L.Takayasu arteritis in China：a report of 530 cases.Heart Vessels Suppl，1992，7：32-36.

［5］Lv N，Dang A，Zhu X，et al.The role of tumor necrosis factoralpha promoter genetic variation in Takayasu arteritis susceptibility and medical treatment.J Rheumatol，2011，38：2602-2607.

［6］Isobe M.Takayasu arteritis revisited：current diagnosis and treatment.Int J Cardiol，2013，168：3-10.

［7］Dong RP，Kimura A，Numano F，et al.HLA-linked susceptibility and resistance to Takayasu arteritis.Heart Vessels Suppl，1992，7：73-80.

［8］Dang A，Wang B，Zhang Y，et al.Association of the HLADRB1 gene with susceptibility to aortoarteritis in a Chinese Han population.Hypertens Res，2002，25：631-634.

［9］Olerup O，Aldener A，F(xiàn)ogdell A.HLA-DQB1 and-DQA1 typing by PCR amplification with sequence-specific primers（PCRSSP）in 2 hours.Tissue Antigens，1993，41：119-134.

［10］黃維義，彭永權，石娟.多發(fā)性大動脈炎累及冠狀動脈致急性心肌梗死一例.中國心血管病研究，2004，2：1004.

［11］Morzycka-Wroblewska E，Munshi A，Ostermayer M，et al.Differential expression of HLA-DQA1 alleles associated with promoter polymorphism.Immunogenetics，1997，45：163-170.

The association of polymorphisms in the HLA-DQ gene with Takayasu arteritis

LYU Na-qiang，DANG Ai-min，ZHENG De-yu，et al.Special Medical Treatment Center，F(xiàn)uwai Hospital，Beijing 100037，China

Objective Takayasu arteritis（TA）is a chronic inflammatory arteritis affecting the aorta and its main branches.In this study a population based case-control study was used to analyze the association of polymorphisms in the HLA-DQA1 gene and DQA1 promoter（QAP）with the development of TA in Chinese Han population.Methods The study selected 100 TA patients and 104 healthy control subjects.Genotyping of polymorphisms in the coding region of HLA-DQA1 gene were performed with polymerase chain reaction-sequence specific primer（PCR-SSP）.Polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism（PCR-SSCP） was used to screen the mutations in the promoter region of HLA-DQA1 gene.Results The frequency of DQA1*0301/2/3 allele in TA patients was significantly lower than that in control subjects（P=0.003）.The frequency of QAP 1.3 in TA patients was significantly lower than that in control subjects（P=0.036）.Conclusion The alleles of DQA1*0301/2/3，QAP1.3 are the resistant factors to TA.

Takayasu arteritis； DQA1 allele； HLA gene

DANG Ai-min，E-mail：gemmadang@163.com

國家自然科學基金（項目編號：30370568）

黨愛民，E-mail：gemmadang@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.08.001

R543.1

A

1672-5301（2014）08-0673－04

2014-06-22）