HPLC法同時(shí)測(cè)定白屈菜中白屈菜堿和白屈菜紅堿

馬 寧，肖光玲，高 宇，李彥冰

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱150040)

白屈菜又名地黃連、牛金花、土黃連、斷腸草、雄黃草、假黃連，為罌粟科白屈菜屬植物白屈菜(Chelidonium majus L)的全草.味苦，性涼.有毒.具有解痙止痛、止咳平喘的功能，用于胃脘攣痛、咳嗽氣喘、百日咳[1].其主要的活性成分為異喹啉類生物堿，包括白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿、原阿片堿等[2].本文采用反相高效液相色譜法[3-5]同時(shí)測(cè)定了藥材白屈菜中含白屈菜堿和白屈菜紅堿的量.

1 儀器與試藥

戴安Ultimate3000高效液相色譜儀(VWD-3400型紫外檢測(cè)器、LPG-3400A型泵、WPS-3000型自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000型柱溫箱、Chromeleon色譜工作站)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；電子分析天平(AB204-N，梅特勒-托利多儀器上海有限公司).

乙腈為色譜純；磷酸、鹽酸、二氯甲烷均為分析純；水為娃哈哈純凈水.對(duì)照品：白屈菜堿(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：120530)，白屈菜紅堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111718-200501)，白屈菜藥材購(gòu)于哈爾濱市藥材市場(chǎng)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李彥冰教授鑒定為白屈菜(Chelidonium majus).

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液制備

精密稱取對(duì)照品白屈菜堿5.00 mg、白屈菜紅堿5.00 mg，置于10 mL量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液.精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，制成混合對(duì)照品溶液.

2.1.2 供試品溶液

稱取白屈菜藥材粗粉，加10倍量的95%乙醇，回流3次，每次40 min，收集醇提液，減壓回收乙醇得稠膏，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至2～3，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至9～10，用等量的二氯甲烷萃取6次(至水層無(wú)生物堿顯色反應(yīng))，收集二氯甲烷液，回收二氯甲烷，干燥至恒重，得白屈菜藥材二氯甲烷萃取物.稱取1 g二氯甲烷萃取物置于100 mL量瓶，用甲醇溶解，搖勻定容，備用.

2.2 色譜條件

色譜柱：依利特Hypersil ODS2(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動(dòng)相: 乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(38∶62，磷酸二氫鉀水溶液用磷酸調(diào)至pH=3)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：282 nm；柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量20 μL，在上述色譜條件下，對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1.

A圖1-白屈菜堿 2-白屈菜紅堿; B圖3-白屈菜堿 7-白屈菜紅堿圖1 混合對(duì)照品(A)、藥材樣品(B)的HPLC圖

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液(50 μg/mL)5、10、15、20、25、30 μL依次注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積.按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定以混合對(duì)照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.白屈菜堿、白屈菜紅堿的回歸方程分別為：Y=20.823X-0.0005R2=0.9999、Y=53.058X-0.0625R2=0.9999結(jié)果表明白屈菜堿和白屈菜紅堿進(jìn)樣量均在0.25～ 1.50 mg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好.

2.4 精密度試驗(yàn)

按照“2.1.1”項(xiàng)下制備混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，共6次，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件操作，記錄6次白屈菜堿和白屈菜紅堿的峰面積，RSD值(n=6)分別為0.25%，0.19%.結(jié)果表明，儀器精密度良好.

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取白屈菜藥材二氯甲烷萃取物按照“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件操作，記錄峰面積值，RSD值分別為0.27%、0.32%，結(jié)果表明，供試品中白屈菜堿和白屈菜紅堿在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取白屈菜藥材二氯甲烷萃取物按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣量20 μL，進(jìn)樣6次，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件操作，記錄白屈菜堿和白屈菜紅堿的峰面積，RSD值分別為0.49%、0.52%，結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好.

2.7 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取同一已知含量二氯甲烷萃取物6份，每份0.5 g，分別按二氯甲烷萃取物中白屈菜堿和白屈菜紅堿含有量的100%加入混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法, 依照“2.2”項(xiàng)下色譜條件操作,記錄峰面積，計(jì)算回收率，平均加樣回收率白屈菜堿和白屈菜紅堿分別為(n=6)98.72%、97.34%，RSD=0.65%、0.86%，表明該方法準(zhǔn)確.

2.8 樣品的測(cè)定

稱取干燥后的白屈菜藥材粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)得3批白屈菜藥材二氯甲烷萃取物中含白屈菜堿量分別為5.688、5.687、5.686 mg/g；含白屈菜紅堿量分別為2.719、2.717、2.718 mg/g.

3 結(jié) 語(yǔ)

本試驗(yàn)曾采用不同的流動(dòng)系統(tǒng)，對(duì)乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液系統(tǒng)不同比例進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果采用乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(38∶62)流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，所測(cè)得白屈菜堿峰和白屈菜紅堿峰均與其他組分峰能達(dá)到較好的分離.

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010.

[2] 黃 松, 杜方麓. 罌粟科白屈菜族的化學(xué)成分及植物化學(xué)分類依據(jù)的研究進(jìn)展[J]. 湖南中藥導(dǎo)報(bào), 2002, 8(10):582-584.

[3] 左金梁, 白 璐, 宋欣鑫, 等. RP-H PLC法同時(shí)測(cè)定白屈菜藥材中血根堿、小檗堿和白屈菜紅堿的含量[J].藥物分析雜志, 2008, 28(6):903.

[4] 安彩賢, 楊廣德, 葉建濤, 等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定小博落回中血根堿和白屈菜紅堿的含量[J].中成藥, 2001, 23(11):824.

[5] 季宇彬，孟凡影，曲中原，等.白屈菜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞Cdk1、cyclinB1表達(dá)影響[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，28(1)：1-3.