孕酮對(duì)妊娠期女性CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響研究

劉新貴，趙鳳亭，孫瑩璞，胡琳莉

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心，河南鄭州450052；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南鄭州450052）

孕酮對(duì)妊娠期女性CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響研究

劉新貴1，趙鳳亭2，孫瑩璞1，胡琳莉1

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心，河南鄭州450052；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南鄭州450052）

目的探討孕酮對(duì)妊娠期女性外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平的影響。方法選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的先兆流產(chǎn)妊娠患者20例，為先兆流產(chǎn)組，孕酮注射液20mg，肌肉注射，1天1次，連續(xù)治療5 d；另選取本院行正常妊娠檢查的妊娠患者20例，為正常妊娠組；以及行體檢正常未孕者20例，為正常未孕組。分別于晨起空腹抽取3組患者靜脈血，采用放射免疫發(fā)光法檢測(cè)3組血清孕酮水平；用流式細(xì)胞檢測(cè)方法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例；采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)。結(jié)果治療前，正常妊娠組和先兆流產(chǎn)組血清孕酮水平、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例和單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)水平均顯著高于正常未孕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常妊娠組孕酮水平、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例和單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)水平顯著高于先兆流產(chǎn)組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。先兆流產(chǎn)組患者予以黃體酮注射液治療結(jié)束后，外周血中血清孕酮水平、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例和Foxp3 mRNA表達(dá)水平均顯著高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論外周血孕酮與CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平呈正相關(guān)，先兆流產(chǎn)患者外周血孕酮和CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平均低于正常妊娠患者，提示這些調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠維持人類(lèi)正常妊娠，防止流產(chǎn)，對(duì)臨床具有指導(dǎo)意義。

孕酮；妊娠；CD4＋CD25＋Foxp3＋；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

先兆流產(chǎn)是指妊娠28周前出現(xiàn)陰道少量流血，伴有下腹部疼痛或者腰部疼痛癥狀，子宮頸口未開(kāi)，無(wú)妊娠物排出，若不及時(shí)治療，將發(fā)展為難免流產(chǎn)［1］。先兆流產(chǎn)早期癥狀不典型，臨床上無(wú)法預(yù)測(cè)先兆流產(chǎn)的發(fā)生，容易誤診，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局［2-3］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取精神支持治療和激素治療等療法。研究發(fā)現(xiàn)［4］，母體和胚胎的免疫耐受在正常妊娠中起到重要作用，當(dāng)免疫耐受出現(xiàn)障礙時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致妊娠失敗，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是母體-胚胎免疫耐受的重要調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能維持與轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和孕酮的關(guān)系密切。本研究旨在通過(guò)觀察孕酮水平與外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例及單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)水平，來(lái)探究孕酮對(duì)妊娠期女性外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月～2013年12月來(lái)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院行先兆流產(chǎn)治療妊娠患者20例，平均年齡（26.14±7.61）歲；來(lái)本院行正常妊娠檢查的妊娠患者20例，平均年齡（25.52±6.78）歲；以及來(lái)本院行體檢正常未孕者20例，平均年齡（27.68±8.16）歲。3組研究對(duì)象的一般資料相仿，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 先兆流產(chǎn)［5］：①有明顯停經(jīng)史；②妊娠時(shí)間不到28周；③陰道有少量出血，伴有下腹部輕度疼痛或者腰背痛；④婦查：宮口未開(kāi)，無(wú)妊娠物排出，子宮大小與停經(jīng)時(shí)間相符；⑤彩超可見(jiàn)妊娠囊，但遲遲未見(jiàn)胎心出現(xiàn)；⑥每48 h人體絨毛促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）水平升高不到65%。

正常妊娠［6］：①有明顯停經(jīng)史；②陰道無(wú)異常流血，無(wú)腹痛或腰痛，無(wú)其他不適癥狀；③彩超可見(jiàn)妊娠囊、胎兒及胎；子宮大小與停經(jīng)時(shí)間相符；④血HCG水平有倍增時(shí)間。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合先兆流產(chǎn)和正常妊娠的診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡19～36歲；妊娠時(shí)間小于28周；患者自愿參與本實(shí)驗(yàn)，并簽署知情同意書(shū)；經(jīng)所在單位倫理學(xué)相關(guān)機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 心、肝、膽嚴(yán)重疾?。粣盒阅[瘤；自身免疫性疾病；糖尿?。桓哐獕?；有不良孕產(chǎn)史；患有病毒性肝炎等傳染病患者；神志異常以及近2個(gè)月來(lái)服用增強(qiáng)免疫力的藥物的患者。

1.5 治療方法 先兆流產(chǎn)組確診為先兆流產(chǎn)后，予以黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33020828）20mg，肌肉注射，1天1次，連續(xù)治療5 d。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 各組實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象于晨起空腹抽取靜脈血2 mL，加入含EDTA-K2抗凝劑的真空管中混勻，離心分離血清，立刻檢測(cè)，采用放射免疫發(fā)光法檢測(cè)3組患者血清孕酮水平。按照稀釋、單個(gè)核細(xì)胞分離、純化、洗滌、重懸、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活性的判定和調(diào)整濃度的步驟制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的百分比。取單個(gè)核細(xì)胞懸液100μL行RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)定量分析，通過(guò)成像分析scion軟件計(jì)算和比較單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3產(chǎn)物條帶的吸光度值，并與β-actin條帶光密度值比較，計(jì)算出單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3在人外周血中mRNA表達(dá)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量資料用“±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前3組患者外周血清孕酮水平及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例比較 正常妊娠組和先兆流產(chǎn)組外周血清孕酮水平均顯著高于正常未孕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而正常妊娠組外周血清孕酮水平顯著高于先兆流產(chǎn)組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常妊娠組和先兆流產(chǎn)組外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例均顯著高于正常未孕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而先兆流產(chǎn)組外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例顯著低于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，如表1）。

表1 3組患者血清孕酮水平以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例比較情況Tab.1 Comparison of serum progesterone levels and proportion of regulatory T cells accounting for CD4＋T cell in three groups

2.2 治療前3組外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較 RT-PCR結(jié)果示：正常妊娠組和先兆流產(chǎn)組外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)水平均高于正常未孕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常妊娠組、先兆流產(chǎn)組和正常未孕組光密度值分別為（0.807±0.031）、（0.516±0.024）和（0.351± 0.037）；而先兆流產(chǎn)組水平低于正常妊娠組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖1）。

圖1 3組外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3＋mRNA表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of Foxp3＋mRNA expression levels in peripheral blood mononuclear cells in three groups

2.3 先兆流產(chǎn)組治療前后外周血孕酮水平、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例比較 先兆流產(chǎn)組患者予以黃體酮注射液治療結(jié)束后，外周血中血清孕酮水平和單個(gè)核細(xì)胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例均顯著高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

表2 治療前后外周血孕酮水平、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例比較Tab.2 Comparison of the progesterone levels in peripheral blood，percent of regulatory T cells accounting for CD4＋T cells

2.4 先兆流產(chǎn)組治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3＋mRNA表達(dá)水平比較 RT-PCR結(jié)果示：治療后外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3＋mRNA表達(dá)水平高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療前和治療后光密度值分別為（0.516±0.024）和（0.705±0.035）（見(jiàn)圖2）。

圖2 治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3＋mRNA表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of Foxp3＋mRNA expression levels in peripheral blood mononuclear cells

3 討論

在正常妊娠中，母體的內(nèi)分泌環(huán)境、免疫功能以及胚胎等條件都起到非常重要的作用，但是性激素特別是孕酮的作用也不可忽略［7-8］。正常妊娠需要母體能夠分泌一定量的孕酮，并能隨著孕周的增加而平穩(wěn)上升，高濃度的孕酮通過(guò)對(duì)增大的子宮產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用而支持早期的正常妊娠。研究表明［9-10］，高濃度的孕酮能夠降低子宮肌纖維和子宮的敏感性，防止子宮收縮而發(fā)生流產(chǎn)，有利于受精卵的正常著床、生長(zhǎng)和發(fā)育。因此低水平的孕酮，會(huì)造成胚胎著床、生長(zhǎng)不良，子宮興奮而產(chǎn)生先兆流產(chǎn)現(xiàn)象［11］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，先兆流產(chǎn)組治療前和正常妊娠組的孕酮水平均顯著高于正常未孕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而正常妊娠組外周血清孕酮水平顯著高于先兆流產(chǎn)組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這也證實(shí)了妊娠女性外周血中孕酮水平高于正常人，并且正常的妊娠需要高濃度的孕酮水平來(lái)支持，低水平的孕酮影響正常妊娠，而產(chǎn)生先兆流產(chǎn)［12］。正常妊娠組和先兆流產(chǎn)組治療前外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例以及Foxp3＋mRNA均表達(dá)水平顯著高于正常未孕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而先兆流產(chǎn)組2指標(biāo)水平均低于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；先兆流產(chǎn)組治療后外周血孕酮水平、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平和Foxp3mRNA均表達(dá)水平顯著高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證明妊娠患者外周血中調(diào)節(jié)行T細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA均表達(dá)水平均高于正常未妊娠者；正常的妊娠需要正常的免疫功能調(diào)節(jié)母體對(duì)胚胎免抗原的耐受能力［13］。先兆流產(chǎn)組黃體酮注射液治療后外周血中調(diào)節(jié)行T細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3均顯著上升，說(shuō)明孕酮水平與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3呈正相關(guān)，提示孕酮可能是通過(guò)調(diào)節(jié)孕酮受體來(lái)提高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3來(lái)增強(qiáng)母-胎的免疫耐受能力，以支持正常妊娠［14-15］。

綜上所述，高濃度的孕酮水平是維持正常妊娠的必要條件，CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持正常妊娠中也具有重要作用；孕酮也能通過(guò)提高CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增強(qiáng)母-胎免疫耐受［17］，支持正常妊娠，防止先兆流產(chǎn)，減輕患者痛苦，具有重要的臨床意義。

［1］馬敬.孕酮對(duì)妊娠期CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響及其調(diào)控機(jī)制［D］.長(zhǎng)沙：中南大學(xué).2013.

［2］周劍，羅邦偉.人外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)及功能研究［J］.免疫學(xué)雜志，2014，30（6）：504-507.

［3］張輝華，李濂.血清孕酮、β-HCG聯(lián)合檢測(cè)在早期先兆流產(chǎn)治療中的臨床價(jià)值［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2014，13（7）：153-154，156.

［4］楊佳雙.血清孕酮、HCG聯(lián)合檢測(cè)在早期先兆流產(chǎn)中的臨床意義［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2014（6）：705-706.

［5］高偉娜，咼月，王麗君，等.針刺對(duì)胚胎著床障礙大鼠CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013（8）：1464-1470.

［6］王露，張政.CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與自身免疫性疾?。跩］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2012，（2）：10-12.

［7］曹衛(wèi)平，錢(qián)秋菊，溫堅(jiān)，等.妊娠期高血壓患者外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及意義［J］.中國(guó)病理生理雜志，2010（7）：1425-1427.

［8］王鋒，潘春霞.血清孕酮、β-人絨毛膜促性腺激素聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)先兆流產(chǎn)結(jié)局的意義［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014（2）：98-100，104.

［9］樊曉然.血清β-HCG及孕酮檢測(cè)在先兆流產(chǎn)的臨床應(yīng)用［J］.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2014（3）：113-115.

［10］何勤徑.血清孕酮、妊娠相關(guān)蛋白A和抑制素A在異位妊娠與稽留流產(chǎn)中的早期診斷價(jià)值［J］.河北醫(yī)藥，2014（6）：873-874.

［11］馬文巧，李秀娟，高麗彩，等.血清hCG和孕酮在早期先兆流產(chǎn)中的臨床意義［J］.臨床合理用藥雜志，2014（11）：58.

［12］蘇桂平.淺談血清孕酮測(cè)定在預(yù)測(cè)早期先兆流產(chǎn)預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值［J］.當(dāng)代醫(yī)藥論叢，2014（2）：178-179.

［13］盧麗為，張雷.孕酮及β-HCG對(duì)異常妊娠早早孕階段妊娠結(jié)局的意義［J］.中國(guó)婦幼保健，2011（1）：28-29.

［14］諶小衛(wèi)，吳志喜，李小毛.血清孕酮和妊娠相關(guān)血漿蛋白A用于早期診斷未破裂型輸卵管妊娠的應(yīng)用價(jià)值［J］.新醫(yī)學(xué)，2011（2）：78-81，141.

［15］郭薇.口服地屈孕酮與肌注黃體酮對(duì)輔助生殖技術(shù)胚胎移植妊娠結(jié)局影響的臨床研究［D］.南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

（編校：劉路路，吳茜）

Effect of progesterone on CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells in pregnancy women

LIU Xin-gui1，ZHAO Feng-ting2，SUN Ying-pu1，HU Lin-li1

（1.Reproductive Center，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；2.Department of Inspection，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

ObjectiveTo investigate the impact of progesterone on level of peripheral blood CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells in pregnant women.Methods20 pregnantwomen with threatened abortion admitted in reproductive center of first affiliated hospital of Zhengzhou university were selected as threatened abortion group，20 normal pregnant women were selected as normal pregnant group，and 20 normal unfertilized women were selected as normal unfertilized group.In threatened abortion group，patientswere given 20mg progesterone injection by intramuscular injection，once a day，for 5 days.In the morning，venous blood was drew from patients with an empty stomach in three groups respectively，radiation immune luminescencemethod was used to detect serum progesterone level of three groups；flow cytometry detection methods was used to detect the percent of CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells accounting for CD4＋T cells in peripheral blood mononuclear cells；reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）technology was used to detect expression of Foxp3 mRNA in mononuclear cells.ResultsBefore treatment，serum progesterone levels，the percent of CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells accounting for CD4＋T cells and expression of Foxp3 mRNA inmononuclear cells in normal pregnant group and threatened abortion group were significantly higher than normal unfertilized group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）；Serum progesterone levels，the percent of CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells accounting for CD4＋T cells and expression of Foxp3 mRNA in mononuclear cells in normal pregnant group were significantly higher than threatened abortion group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.After injection of progesterone，Serum progesterone levels in peripheralblood，the percent of CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells accounting for CD4＋T cells and expression of Foxp3 mRNA in mononuclear cells in threatened abortion group were significantly higher than those before treatment，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion There is a positive correlation between serum progesterone levels in peripheral blood and CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells levels.Serum progesterone levels in peripheral blood and CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells levels in threatened abortion group is higher than normal pregnant group，which suggests these regulatory T cells can sustain human normal pregnancy，preventmiscarriage，and guide the clinic.

progesterone；pregnancy；CD4＋CD25＋Foxp3＋；pegulatory T cells

R714.21

A

1005－1678（2014）08－0124－03

NSFC－河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金（U1304315）

劉新貴，男，碩士，主管技師，研究方向：人類(lèi)生殖與內(nèi)分泌或婦科腫瘤相關(guān)免疫與分子生物，E-mail：liuxinguidr＠126.com。