胃十二指腸疾病易感性與IL-1B-31和TNF-α-1031基因多態(tài)性的關(guān)系研究

王小永，邵偉斌，孫永強(qiáng)

（1.南通市海門市人民醫(yī)院普外科，江蘇南通226100；2.南通市第一人民醫(yī)院肝膽外科，江蘇南通226100；3.南通市第一人民醫(yī)院胃腸外科，江蘇南通226100）

胃十二指腸疾病易感性與IL-1B-31和TNF-α-1031基因多態(tài)性的關(guān)系研究

王小永1，邵偉斌2，孫永強(qiáng)3

（1.南通市海門市人民醫(yī)院普外科，江蘇南通226100；2.南通市第一人民醫(yī)院肝膽外科，江蘇南通226100；3.南通市第一人民醫(yī)院胃腸外科，江蘇南通226100）

目的分析胃十二指腸疾病易感性與IL-1B-31和TNF-α-1031基因多態(tài)性在人群之間的表達(dá)關(guān)系，為胃十二指腸疾病的診斷和預(yù)防提供新的治療理念。方法使用等位特異PCR法和PCR-限制性長度片段多態(tài)方法檢測52例慢性胃炎患者、48例十二指腸潰瘍患者、50例胃癌患者與100例健康對照組的IL-1B-31和TNF-α-1031的基因多態(tài)性。結(jié)果在本次研究中，IL-1B-31和TNF-α-1031位點均存在C／T多態(tài)性，有C／C、T／T、C／T 3種基因型，IL-1B-31基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可見282 bp的條帶，限制性內(nèi)切酶Alu I切割后，C／C型為282 bp，T／T型為100 bp和182 bp，C／T型為100 bp、182 bp和282 bp，TNF-α-1031基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物T／C型是T引物和C引物均可見452 bp的條帶，C／C型是加上C引物可見452 bp的條帶，而T引物未見條帶，T／T型是加上T引物有452 bp的條帶，而C引物未見條帶；本次實驗中的所有基因型及其等位基因的頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。且經(jīng)χ2檢驗分析可知，觀察組的IL-1B-31基因各基因型頻率的分布與對照組無顯著性差異。TNF-α-1031基因各基因型的頻率與對照組比較，在胃炎伴H.pylori患者中、十二指腸潰瘍伴H.pylori感染患者中和胃癌伴H.pylori患者中的頻率均具有顯著性差異（P＜0.05）；在4組風(fēng)險性的比較中，攜帶TNF-α-1031 C／C者發(fā)生慢性胃炎的危險性O(shè)R＝5.69（95%CI：1.00～33.84），發(fā)生十二指腸潰瘍的危險性O(shè)R＝6.87（95%CI：1.19～40.63），發(fā)生胃癌的危險性O(shè)R＝5.98（95%CI：1.09～35.36）。經(jīng)過Spearman等級相關(guān)分析，IL-1B-31與慢性胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌的相關(guān)系數(shù)分別為r1＝0.879，r2＝0.826，r3＝0.901；TNF-α-1031與慢性胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌的相關(guān)系數(shù)分別為r1＝0.426，r2＝0.328，r3＝0.645。結(jié)論 IL-1B-31各基因型與幽門螺桿菌相關(guān)性胃十二指腸疾病的發(fā)生不存在相互關(guān)系。胃炎、十二指腸潰瘍的易感性與TNF-α-1031基因型存在相關(guān)性。

胃十二指腸疾??；白介素-1-B-31；腫瘤壞死因子-A-1031；基因多態(tài)性

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，H.pylori）是當(dāng)前世界上感染率最高的一種病原菌，是引發(fā)人類慢性胃炎、十二指腸潰瘍的關(guān)鍵致病因子，與胃癌等腫瘤性疾病的發(fā)生存在著密切的關(guān)系。近些年研究表明［1-2］，幽門螺旋桿菌的致病性與宿主的易感性和感染的環(huán)境條件存在相互關(guān)系，并且這2種因素已經(jīng)成為幽門螺旋桿菌致病的關(guān)鍵因素。幽門螺旋桿菌感染后，會引起機(jī)體產(chǎn)生局部的細(xì)胞免疫反應(yīng)，如白介素（interleukin，IL）-1、白介素-10及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等大量分泌，從而造成一定程度的胃黏膜損傷，由于以上致炎因子在人群中不同程度的表達(dá)導(dǎo)致幽門螺旋桿菌感染后所致的疾病不同，本研究通過對幽門螺旋桿菌感染的慢性胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌患者體內(nèi)的IL-1B-31和TNF-α-1031的分析，并與各種病情的關(guān)系加以對比，為今后幽門螺旋桿菌感染的胃十二指腸相關(guān)疾病的診斷和治療提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2010年1月～2013年1月于海門市人民醫(yī)院消化內(nèi)科住院的慢性胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌伴H.pylori陽性者共150例，分為3個觀察組，其中慢性胃炎患者52例，女20例（38.46%），男32例（61.54%），年齡為25～58歲，平均年齡為（36.35±6.2）歲；十二指腸潰瘍患者48例，女19例（39.58%），男29例（60.42%），年齡為27～60歲，平均年齡（38.02±5.4）歲；胃癌患者50例，女23例（46%），男27例（54%），年齡為26～62歲，平均年齡為（39.11±4.02）歲。觀察組所有患者均通過胃鏡和組織病理學(xué)檢查后確診。同時隨機(jī)選取來本院進(jìn)行健康體檢的H.pylori陽性者共100例為對照組，女41例（41%），男59例（59%），年齡為24～64歲，平均年齡為（36.02±5.86）歲，對照組經(jīng)檢查均無慢性胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌的病史。采用調(diào)查問卷和病歷記錄的方式收集患者的所有臨床資料，采集2組人員的信息前均簽訂了醫(yī)院倫理委員會發(fā)布的知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 －20℃冰箱（Thermo公司），PCR擴(kuò)增儀（Pekirn Elmer公司），水浴箱（上海醫(yī)用分析儀器廠），高速臺式離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠），DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠），Synthesis超純水系統(tǒng)（美國Milipore公司），22331Hamburg基因擴(kuò)增儀（德國Eppendorf公司），BioSens Sc810凝膠成像儀（上海山富科學(xué)儀器有限公司；胃幽門螺桿菌抗體檢測試劑盒（重慶順捷醫(yī)療器械有限公司），胃幽門螺桿菌快速檢測試紙（廣州貝思奇診斷試劑有限公司），Premix Taq PCR試劑盒，DNA片段長度標(biāo)準(zhǔn)50bp DNA，限制性內(nèi)切酶Alu I，瓊脂糖（寶生物工程有限公司產(chǎn)品），三羥甲基氨基甲烷（Tris）（上海生工生物工程公司），EDTA（重慶東方試劑廠），Goldview核酸染料（北京賽百盛基因技術(shù)公司），其余試劑均由重慶川東化工公司提供。

1.3 材料 從慢性胃炎、十二指腸潰瘍、胃癌和健康體檢的H.pylori陽性者體內(nèi)抽取2mL靜脈血，將其中1mL全血置于1.5mL的離心管中，分離出血清分裝于1.5mL的離心管中。

1.4 引物寡核苷酸 根據(jù)Sugimoto M等［3-4］的研究，使用Primer Premier5.2軟件，設(shè)計檢測IL-1B-31和TNF-α-1031基因多態(tài)性的引物，其序列見表1，設(shè)計出來的引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成公司負(fù)責(zé)合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 H.pylori陽性的檢測 血清H.pylori抗體檢測采用金標(biāo)免疫斑點法，取血清樣本30μL，以生理鹽水稀釋5倍后，嚴(yán)格按照說明書的步驟進(jìn)行操作，陰性結(jié)果為反應(yīng)孔中只顯示紅色的橫線，陽性結(jié)果為反應(yīng)孔中出現(xiàn)紅色的圓斑，若反應(yīng)孔中既無圓斑又無紅色橫線出現(xiàn)則說明試劑無效。

胃粘膜的H.pylori感染采用尿素酶法來檢測，嚴(yán)格按照說明書的步驟進(jìn)行操作，并觀察試紙在3min之內(nèi)的顏色，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確度。若待檢的胃黏膜組織邊緣在1 min內(nèi)由黃變紅則為強(qiáng)陽性，若變化緩慢則為弱陽性，不變色則為陰性。

1.6 細(xì)胞因子基因多態(tài)性的檢測 采集所有受試者的靜脈血2mL，參考向喻［5］的研究，使用EDTA-K2抗凝，以改良的碘化鈉法提取血清中的白細(xì)胞基因組DNA，保存于－20℃的冰箱中，備用。

PCR反應(yīng)體系包括5 pmoL的引物，10μL Premix Taq（Taq DNA聚合酶，dNTP，Mg2＋），模版DNA 4μL，以超純水補(bǔ)至總體積為20μL。IL-1B-31和TNF-α-1031的基因檢測PCR反應(yīng)條件見表2。

表2 測定IL-1B-31和TNF-α-1031基因多態(tài)性的PCR反應(yīng)條件Tab.2 PCR reaction conditions of IL-1B-31，and TNF-α-1031 gene polymorphism measure

使用限制性內(nèi)切酶Alu I對IL-1B-31擴(kuò)增產(chǎn)物在37℃的水浴箱中進(jìn)行酶切處理，而后以2%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，而后進(jìn)行Goldview染色并將DNA條帶使用凝膠成像儀觀察，記錄結(jié)果，由于TNF-α-1031引物的特殊性，不可進(jìn)行酶切分析，故本實驗對TNF-α-1031引物采用直接凝膠電泳以觀察基因的突變位點。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對各基因型及其等位基因頻率的計算采用頻數(shù)計數(shù)法，并經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢測研究對象的同一種群度。2組間的基因型頻率差異采用χ2檢驗，各因素間的相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析。以P＜0.05表示為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以優(yōu)勢比（odds ratio，OR）及95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示各基因型發(fā)生H.pylori相關(guān)性胃十二指腸疾病的危險性。采用Logistic回歸計算優(yōu)勢比值，且在本次實驗中的所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物的鑒定 經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，IL-1B-31基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可見282 bp的條帶，限制性內(nèi)切酶Alu I切割后，C／C型為282 bp，T／T型為100 bp和182 bp，C／T型為100 bp、182 bp和282 bp，TNF-α-1031基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物T／C型是T引物和C引物，均可見452 bp的條帶，C／C型是加上C引物可見452 bp的條帶，而T引物未見條帶，T／T型是加上T引物有452 bp的條帶，而C引物未見條帶，結(jié)果見圖1。

圖1 IL-1B-31基因和TNF-α-1031基因的PCR產(chǎn)物及多態(tài)性分析在TNF-α-1031基因的PCR產(chǎn)物中，2、4、6加T引物，3、5、7加C引物Fig.1 IL-1B-31 and TNF-α-1031 gene PCR product and polymorphism analysis in TNF-α-1031 gene PCR amplification product，2，4，6 were combined with T primer，3，5，7 were combined with C primer

2.2 各基因型的分布頻率對比 本次實驗中的所有基因型及其等位基因的頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。且經(jīng)χ2檢驗分析可知，觀察組的IL-1B-31基因各基因型頻率的分布與對照組無顯著性差異。TNF-α-1031基因各基因型的頻率與對照組比較，在胃炎伴H.pylori患者中、十二指腸潰瘍伴H.pylori感染患者中和胃癌伴H.pylori患者中的頻率均具有顯著性差異（χ2＝23.148，P＜0.001；χ2＝9.254，P＜0.05；χ2＝9.264，P＜0.05，見表3）。

表3 各基因型在兩組中的分布頻率對比Tab.3 Comparation of genotype frequencies between two groups

2.3 各基因型發(fā)生胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌的危險性及相關(guān)性 將本實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行Logistic回歸模型分析，其中以自變量X1代表IL-1B-31基因型（X1＝1為T／T型，X1＝2為C／T型，X1＝3為C／C型），自變量X2代表TNF-α-1031基因型（X1＝1為T／T型，X1＝2為C／T型，X1＝3為C／C型），因變量Y代表患病與否，其中Y＝0為對照，Y＝1為慢性胃炎組，Y＝2為十二指腸潰瘍組，Y＝3為胃癌組，分析IL-1B-31基因型與TNF-α-1031基因型發(fā)生慢性胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌的危險性并進(jìn)行Spearman等級相關(guān)分析。結(jié)果顯示，在4組風(fēng)險性的比較中，攜帶TNF-α-1031 C／C者發(fā)生慢性胃炎的危險性O(shè)R＝5.69（95%CI： 1.00～33.84），發(fā)生十二指腸潰瘍的危險性O(shè)R＝6.87（95% CI：1.19～40.63），發(fā)生胃癌的危險性O(shè)R＝5.98（95%CI：1.09～35.36），結(jié)果見表4；經(jīng)過Spearman等級相關(guān)分析，IL-1B-31與慢性胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌的相關(guān)系數(shù)分別為r1＝0.879，r2＝0.826，r3＝0.901；TNF-α-1031與慢性胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌的相關(guān)系數(shù)分別為r4＝0.426，r5＝0.328，r6＝0.645。說明IL-1B-31各基因型與幽門螺桿菌相關(guān)性胃十二指腸疾病的發(fā)生不存在相互關(guān)系。胃炎、十二指腸潰瘍的易感性與TNF-α-1031基因型存在相關(guān)性。

表4 各基因型發(fā)生胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌的危險性Tab.4 Risk comparison of each genotype occurred gastritis，duodenal and gastric cancer

3 討論

在中國惡性腫瘤疾病普查中，胃癌的發(fā)病率和死亡率占同類疾病的首位［6-7］。胃癌作為一種惡性疾病，其主要發(fā)病原因與其遺傳基因的易感性密不可分，而其遺傳基因的易感性中，細(xì)胞因子的多樣性占主要地位［8-9］。通過誘導(dǎo)胃黏膜炎性反應(yīng)中的大量炎性因子，刺激胃酸的特異性分泌，加速對胃黏膜損傷的破壞程度，從而誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生［10-12］。

近些年研究顯示［13］，國內(nèi)外對IL-1B-31基因多態(tài)性與幽門螺旋桿菌感染慢性胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌等結(jié)果各不相同。在本次研究中，IL-1B-31各基因型與幽門螺桿菌相關(guān)性胃十二指腸疾病的發(fā)生不存在相互關(guān)系，此結(jié)果與葉荻慶［14］和Mitsushige Sugimoto［15］的研究結(jié)果相一致，但與Hamajima N等［16］日本學(xué)者的研究不大一致。后來有人發(fā)現(xiàn)，IL-10-819TT和IL-1B-31攜帶者發(fā)生幽門螺旋桿菌感染的慢性胃炎和十二指腸潰瘍的幾率較亞洲其他地方的人均患病率偏高，這就間接表明，IL-1B-31各基因型與幽門螺桿菌相關(guān)性胃十二指腸疾病的相關(guān)性存在地域性差異，但這并不影響本次結(jié)果在今后的研究中的作用和意義。

在本次實驗各基因頻率分布的對比中，觀察組的IL-1B-31基因各基因型頻率的分布與對照組無顯著性差異。TNF-α-1031基因各基因型的頻率與對照組比較，在胃炎伴H.pylori患者中、十二指腸潰瘍伴H.pylori感染患者中和胃癌伴H.pylori患者中的頻率均具有顯著性差異（P＜0.001，P＜0.05），這與張新憲等［17］研究結(jié)果相一致，這就提示了慢性胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌攜帶TNF-α-1031 C／C基因的頻率顯著增加，可能是因為攜帶TNF-α-1031C／C基因型的患者在抗炎過程中其TNF-α的表達(dá)程度較高，加劇了其在胃黏膜中的破壞作用，從而增加了其各類疾病的發(fā)生率。也就說明了TNF-α-1031 C／C基因是幽門螺旋桿菌感染的慢性胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌的易感因子。

［1］蘇善平.IL-1B-31、IL-10-819和TNF-A-1031基因多態(tài)性與胃十二指腸疾病易感性的關(guān)系探討［D］.重慶：重慶醫(yī)科大學(xué).2010.

［2］張軍喜.IL-1、TNF基因多態(tài)性與幽門螺桿菌感染致胃癌的關(guān)系研究［D］.河南：鄭州大學(xué).2007.

［3］Sugimoto M，F(xiàn)uruta T，Shirai N，et al.Effects of interleukin-10 gene polymorphism on the development of gastric cancer and peptic ulcer in Japanese subjects［J］.Gastroenterol Hepatol，2007，22（9）：1443-1449.

［4］Sugimoto M，F(xiàn)uruta T，Shirai N，et al.Different effects of polymorphisms of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta on development of peptic ulcer and gastric cancer［J］.Gastroe-Nterol Hepatol，2007，22（1）：51-59.

［5］向瑜.IL-1和TNF-Α基因多態(tài)性與幽門螺桿菌相關(guān)性胃十二指腸疾病關(guān)系的探討［D］.重慶：重慶醫(yī)科大學(xué).2009.

［6］張云霞，王郁杰，朱瑩.幽門螺旋桿菌感染與胃癌相關(guān)性探討［J］.中華醫(yī)院感染性雜志，2014，24（7）：1700-1704.

［7］田磊，肖秀英，葉明.胃癌分子靶向藥物治療的研究進(jìn)展［J］. 2014，22（6）：773-781.

［8］張琦，徐智，陳錦飛.胃癌藥物治療進(jìn)展［J］.癌癥進(jìn)展，2014，12（1）：22-28.

［9］王冬青，丁西平，殷 實.促炎細(xì)胞因子在胃癌前病變中的作用［J］.世界華人消化雜志，2014，22（1）：39-45.

［10］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer JClin，2011，61：69-90.

［11］Tsujimoto H，Ono S，Ichikura T，et al.Roles of inflammatory cytokines in the progression of gastric cancer：friends or foes？［J］. Gastric Cancer，2010，13：212-221.

［12］Putoczki TL，Thiem S，Loving A，et al.Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically［J］.Cancer Cell，2013，24：257-271.

［13］Fehlings M，Drobbe L，Moos V，et al.Comparative analysis of the interaction of Helicobacter pylori with human dendritic cells，macrophages，and monocytes.［J］.Infect Immun，2012，80：2724-2734.

［14］葉荻慶，向瑜，張莉萍，等.IL-1基因多態(tài)性與幽門螺桿菌相關(guān)性胃十二指腸疾病的關(guān)系［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（24）：3375-3377.

［15］Sugimoto M，Shirai N，Nishino M，etal.Comparison of acid inhibition with standard dosagesof proton pump inhibitors in relation to CYP2C19 genotype in Japanese［J］.European Journal of Clinical Pharmacology，2014，17：1713.

［16］Hamajima N，Katsuda N，Matsuo K，et al.High Anti-Helicobacter pylori Antibody Seropositivity Associated with the Combination of IL-1and IL-10-819TT［J］.Genotypes Helicobacter，2013，8（2）：105-110.

［17］張新憲，汪枝梅.原發(fā)性十二指腸胃反流程度與胃部炎性反應(yīng)關(guān)系的研究［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22（7）：664-666.

（編校：譚玲，秦曉英）

Study on the relationship between gastroduodenal disease susceptibility and IL-1B-31 and TNF-α-1031 gene polymorphism

WANG Xiao-yong1，SHAOWei-bin2，SUN Yong-qiang3

（1.Department of General Surgery，Haimen People's Hospital，Nantong 226100，China；2.Department of Hepatobiliary Surgery，Nantong First People's Hospital，Nantong 226100，China；3.Department of Gastrointestinal Surgery，Nantong First People's Hospital，Nantong 226100，China）

ObjectiveTo analyze the relationship between gastroduodenal diseases susceptibility and IL-1B-31 and TNF-α-1031 gene polymorphism between people，provide a new treatment concept for diagnosis and prevention of gastroduodenal diseases.Methods52 cases of chronic gastritis，48 cases of duodenalulcer，50 cases of gastric cancer patients and 100 cases ofhealthy population were detected on IL-1B-31 and TNF-α-1031 gene polymorphism by allele-specific PCR and PCR-restriction fragment length polymorphism method.ResultsThe results showed that there were C／T polymorphisms in IL-1B-31 and TNF-α-1031 sites，included C／C，T／T，C／T three genotypes，282 bp band was found in IL-1B-31 gene PCR amplification product and cleavaged by restriction endonuclease Alu I，the C／C type turned to 282 bp，T／T type turned to 100 bp and 182 bp，C／T type turned to 100 bp，182 bp and 282 bp，452 bp was found in TNF-α-1031 gene PCR amplification product T／C type，which were T primer and C primer，452 bp was found in C／C type coupled with C-type primer，while band was not found in T-type primer，452 bp band was found in T／T type coupled with T-type primer，while band was not found in C-type；In this experiment，all genotypes and allele frequencies conformed to Hardy-Weinberg genetic equilibrium.Byχ2test and analysis，there was no significant difference of IL-1B-31 gene genotype frequencies distribution in observation group compared with control group.Compared with the control group，TNF-α-1031 genotype frequencies in gastritis patients with H.pylori，duodenal ulcer patients with H.pylori fection and gastric cancer patients with H.pyloriwere significant differences（P＜0.05）；In the four groups of risk comparison，the risk ofpatients with TNF-α-1031 C／C occurred chronic gastritis OR＝5.69（95%CI：1.00～33.84），the risk of the occurrence of duodenal ulcer OR＝6.87（95%CI：1.19～40.63），the risk of gastric cancer OR＝5.98（95%CI：1.09～35.36）.By Spearman rank correlation analysis，correlation coefficients of IL-1B-31 and chronic gastritis，duodenal ulcers and gastric cancerwere r1＝0.879，r2＝0.826，r3＝0.901；the correlation coefficients of TNF-α-1031 and chronic gastritis，duodenal ulcer and gastric cancer were r1＝0.426，r2＝0.328，r3＝0.645．Conclusion There is no correlation between the IL-1B-31 genotype and Helicobacter pylori-related gastroduodenal diseases，Gastritis，duodenal ulcer susceptibility and TNF-α-1031 genotype exist relationship.

gastroduodenal diseases；interleukin-1-B-31；tumor necrosis factor-A-1031；gene polymorphism

R972

A

1005－1678（2014）08－0106－04

王小永，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：腹腔鏡膽道，E-mail：wxy13862850099＠163.com。