泛素交聯(lián)酶UBE2D3在調(diào)節(jié)人乳腺癌MCF-7細胞放射敏感性中的作用

朱強，王丕琳，張鐵，尹子毅，曲更寶，殷詠梅

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院乳腺科，北京100050；2.南京醫(yī)科大學乳腺科，江蘇南京210029）

泛素交聯(lián)酶UBE2D3在調(diào)節(jié)人乳腺癌MCF-7細胞放射敏感性中的作用

朱強1，王丕琳1，張鐵1，尹子毅1，曲更寶1，殷詠梅2

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院乳腺科，北京100050；2.南京醫(yī)科大學乳腺科，江蘇南京210029）

目的研究泛素交聯(lián)酶UBE2D3（ubiquitin-conjugating enzyme E2D3）在端粒酶介導(dǎo)的放射敏感性調(diào)節(jié)機制中的作用。方法針對UBE2D3基因序列，設(shè)計3條干擾序列，通過篩選選取1條干擾效率最優(yōu)的序列并合成pshRNA-UBE2D3；在MCF-7細胞中，轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒pEGFP-UBE2D3以及干擾質(zhì)粒pshRNA-UBE2D3，Western blot檢測UBE2D3對hTERT蛋白表達的影響；通過轉(zhuǎn)染pEGFP-hTERT，Western blot法檢測hTERT蛋白表達對UBE2D3的影響；通過轉(zhuǎn)染pshRNA-UBE2D3抑制UBE2D3的表達，PCR-ELISA法檢測端粒酶活性，MTT法檢測MCF-7細胞周期的變化，CCK-8法檢測MCF-7細胞增殖情況，克隆形成法檢測MCF-7細胞放射敏感性的變化。結(jié)果成功篩選出一條針對UBE2D3的最優(yōu)干擾序列，干擾UBE2D3能顯著降低MCF-7細胞的放射敏感性；UBE2D3能參與hTERT調(diào)控放射敏感性的調(diào)節(jié)，抑制UBE2D3的表達可能通過上調(diào)hTERT和Cyclin D1的表達、增加hTERT的活性、加速G1期向S期轉(zhuǎn)變以及提高MCF-7細胞的增殖從而降低MCF-7細胞的放射敏感性。然而，過表達UBE2D3未能檢測到hTERT的表達差異。結(jié)論抑制UBE2D3可能通過上調(diào)hTERT以及Cyclin D1的表達參與hTERT調(diào)節(jié)的放射敏感性的過程。

泛素交聯(lián)酶UBE2D3；放射敏感性；蛋白相互作用；乳腺癌

泛素-蛋白酶體復(fù)合通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是Hershko等研究者在20世紀末發(fā)現(xiàn)的一種高效的蛋白質(zhì)降解的通路，該通路不但能夠破壞損傷陳舊的蛋白質(zhì)，而且能夠通過精確降解細胞內(nèi)各種目的靶蛋白，進而參與細胞周期的調(diào)控、細胞凋亡、DNA修復(fù)、細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白的跨膜定位和細胞表面膜受體的內(nèi)化等多種生理過程，與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，尤其與腫瘤的發(fā)生有著密切的相關(guān)性［1-2］。泛素（ubiquitin）是一個高度保守的、長76個氨基酸殘基的小肽，它以單體或與其他蛋白結(jié)合的形式廣泛存在真核生物中，不僅是蛋白質(zhì)降解的標記，更在DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動中發(fā)揮著重要的作用［3］。為此選取UBE2D3作為研究對象，研究UBE2D3在端粒酶介導(dǎo)的放射敏感性調(diào)節(jié)機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種、細胞株 質(zhì)粒：過表達質(zhì)粒pEGFPUBE2D3用于真核表達；干擾質(zhì)粒pshRNA-UBE2D3用于真核表達；菌種及細胞株：E.coli DH5α購自天根生化公司，MCF-7細胞由江西省腫瘤生物行為學實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 DMEM培養(yǎng)基購于美國HyClone公司，胎牛血清（FBS）購于杭州四季青生物工程有限公司。胰蛋白胨（trytone）、酵母提取物（yeast extract）、瓊脂粉（agar）購自O(shè)XOID公司。瓊脂糖購自西班牙Agarose公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。細胞總RNA提取試劑Trizol reagent、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000均購自Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和dNTP購自Promega公司；DNA凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；DNA Marker、PCR Mix均購自天根生化公司；BCA蛋白測定試劑盒、細胞周期檢測試劑盒購自碧云天公司；端粒酶活性試劑盒購自Roche公司；CCK-8試劑盒購自Dongji公司；DNA測序由Invitrogen公司完成。

1.3 主要儀器 Bio 1200-II-A2型生物安全柜（上海振梓創(chuàng)）；SW-CJ-1F型潔凈工作臺（蘇州安泰）；MCO-175型CO2恒溫培養(yǎng)箱、－20℃醫(yī)用冰箱、－70℃超低溫冰箱、OLYMPUS倒置普通顯微鏡、OLYMPUS倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS）；TGL-16G臺式高速離心機（上海醫(yī)用分析儀器廠）；Microfuge-22R臺式微量冷凍離心機（美國Beckman）；Allerga X-12R多功能離心機（美國Beckman）；細胞計數(shù)儀（Invitrogen）；A1604型精密天平（上海天平儀器廠）；WGP-350隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海安亭）。

1.4 方法

1.4.1 針對UBE2D3基因序列，設(shè)計3條干擾序列，通過篩選選取1條干擾效率最優(yōu)的序列并合成pshRNA-UBE2D3；在MCF-7細胞中，轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒pEGFP-UBE2D3以及干擾質(zhì)粒pshRNA-UBE2D3。

1.4.2 Western blot檢測UBE2D3對hTERT蛋白表達的影響：取適量25mg／mL蛋白標準溶液稀釋至終濃度0.5mg／mL，同時按50∶1比例分別加入適量試劑A和試劑B配制BCA工作液；試劑準備完畢后，于96孔板中分別加入0、1、2、4、8、12、16、20μL標準品以及10μL的待測樣品，補足稀釋液至20μL；每孔加入BCA工作液200μL，37℃孵育30min；使用酶標儀測定562 nm的吸光度，繪制標準曲線并計算蛋白濃度。

1.4.3 通過轉(zhuǎn)染pEGFP-hTERT，Western blot法檢測hTERT蛋白表達對UBE2D3的影響：將4μL LipofectamineTM 2000分別加入2個500μLOPT-MEM培養(yǎng)基的EP管中，輕柔混勻，且室溫孵育5min。將上述2種稀釋液分別混勻，室溫培育20min后加入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。4～6 h后，輕柔棄除轉(zhuǎn)染混合物，切忌用力吹打，用吸管沿瓶壁緩慢更換上新鮮的完全培養(yǎng)基；48 h后，按照標準步驟分別提取蛋白，利用BCA法檢測蛋白濃度。

1.4.4 干擾UBE2D3對MCF-7細胞增殖的影響：CCK-8法采用的主要試劑是WST-8，它是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。如果細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。以轉(zhuǎn)染pshRNA-UBE2D3的MCF-7細胞為實驗組，pshRNA-NC為對照組。

1.4.5 干擾UBE2D3對MCF-7細胞放射敏感性的影響：將處于凍存管內(nèi)凍存的MCF-7細胞置于37℃水浴中溫浴，待細胞溶化后，用75%乙醇消毒管壁外測盡量保持無菌，超凈工作臺內(nèi)將熔化的細胞轉(zhuǎn)到另一個15mL無菌離心管中，加入10mL含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，2000 rpm，離心5min；收集細胞，棄上清；再加入5mL含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，用吸管輕柔吹打，重懸細胞，將細胞接種至細胞培養(yǎng)瓶中，置于5%C02培養(yǎng)箱中，37℃常規(guī)培養(yǎng)；提前1 d準備處于對數(shù)生長的人乳腺癌MCF-7細胞，消化，均勻種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶；待細胞狀態(tài)良好，按照之前轉(zhuǎn)染步驟，按照無菌原則將pshRNA-UBE2D3（實驗組）、pshRNA-NC（對照組），采用線性二次模型擬合細胞存活曲線，通過曲線計算細胞存活分數(shù)為0.5時，對照組與實驗組的放射劑量比值為放射增敏比（sensitizer enhancementratio，SER）。

1.5 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，Western blot、端粒酶活性檢測、細胞增殖檢測、細胞周期檢測、克隆形成實驗均重復(fù)至少3次，端粒酶活性檢測、細胞增殖檢測采用t檢驗，克隆形成實驗數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 5.0軟件分析，按照線性二次模型擬合生存曲線，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 UBE2D3干擾最佳序列篩選以及過表達質(zhì)粒pEGFPUBE2D3的構(gòu)建 為了研究UBE2D3在放射敏感性中的作用，共設(shè)計3條干擾序列，分別將3條序列轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞，進而篩選出1條干擾效率最好的干擾序列。如圖1A所示，轉(zhuǎn)染后，Line-1（siRNA-486）顯示最好干擾效率，選取干擾序列siRNA-486，用以構(gòu)建pU6／GFP／Neo-shRNA-UBE2D3，簡稱pshRNAUBE2D3。同時，構(gòu)建pEGFP-UBE2D3，如圖1B所示，測序完全正確。

圖1 UBE2D3干擾序列篩選結(jié)果（A）及pEGFP-UBE2D3雙酶切鑒定結(jié)果（B）Fig.1 UBE2D3 interference sequence screening results（A）and pEGFP-UBE2D3 double enzyme digestion identification results（B）

2.2 干擾、過表達UBE2D3對MCF-7細胞中hTERT蛋白表達影響 以重組質(zhì)粒pEGFP-UBE2D3、pshRNA-UBE2D3為實驗組，pshRNA-NC作為對照組，轉(zhuǎn)染MCF-7細胞24 h后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率（圖2A），實驗組以及對照組轉(zhuǎn)染效率均在80%左右；48 h后提取蛋白，WB檢測干擾、過表達UBE2D3后，hTERT的蛋白表達變化。如圖2B所示，轉(zhuǎn)染pEGFP-UBE2D3后，UBE2D3蛋白表達水平增加，hTERT蛋白水平較對照組未見明細變化；而轉(zhuǎn)染pshRNA-UBE2D3后，UBE2DE3蛋白表達水平降低，hTERT蛋白水平較對照組明顯增加。

圖2 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率（A）及Western blot檢測蛋白表達（B）Fig.2 Transfection efficiency observed by fluorescentmicroscope（A）and protein expression detected by Western blot（B）

2.3 過表達hTERT對MCF-7細胞中UBE2D3蛋白表達的影響 為了研究hTERT的表達對MCF-7細胞中UBE2D3蛋白表達的影響，以重組質(zhì)粒pEGFP-hTERT為實驗組，pEGFP-C1作為對照組，轉(zhuǎn)染MCF-7細胞24 h后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率（圖3A），實驗組以及對照組轉(zhuǎn)染效率均在70%左右；48 h后提取蛋白，Western blot檢測過表達hTERT對UBE2D3的蛋白表達變化的影響。如圖3B所示，轉(zhuǎn)染pEGFP-hTERT后，hTERT蛋白表達水平較對照組升高，而UBE2DE3蛋白表達較對照組未見明顯變化；

圖3 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率（A）及Western blot檢測蛋白表達（B）Fig.3 transfection efficiency observed by fluorescentmicroscope（A）and protein expression detected by Western blot（B）

2.4 干擾UBE2D3對MCF-7細胞端粒酶活性的影響 為了檢測UBE2D3對MCF-7細胞端粒酶活性的影響，采用TRAPPCR-ELISA法進行檢測，結(jié)果在不加放射線的情況下，實驗組（轉(zhuǎn)染pshRNA-UBE2D3）與對照組（pshRNA-NC）相比，MCF-7細胞端粒酶活性明顯升高；在加放射線的情況下，實驗組（轉(zhuǎn)染pshRNA-UBE2D3）與對照組（pshRNA-NC）相比，MCF-7細胞端粒酶活性也明顯升高，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖4）。

圖4 PCR-ELISA檢測端粒酶活性Fig.4 PCR-ELISA detection of telomerase activity

2.5 干擾UBE2D3對MCF-7細胞增殖的影響 為研究UBE2D3對MCF-7細胞增殖的影響，通過轉(zhuǎn)染pshRNA-UBE2D3抑制UBE2D3的表達，采用CCK-8法分別在1、2、3、4、5、6、7 d，共7個時間點檢測MCF-7細胞的增殖情況，經(jīng)pshRNA-UBE2D3處理過的MCF-7細胞較轉(zhuǎn)染pshRNA-NC的MCF-7細胞，從第2天開始出現(xiàn)增殖差異，且均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖6 CCK-8法檢測MCF-7細胞增殖Fig.6 The proliferation of MCF-7 cellsmeasured with CCK-8 method

2.6 干擾UBE2D3對MCF-7細胞放射敏感性的影響 在明確干擾質(zhì)粒pshRNA-UBE2D3對hTERT的表達效應(yīng)后，分別轉(zhuǎn)染pshRNA-UBE2D3和陰性對照組pshRNA-NC至MCF-7細胞。轉(zhuǎn)染24 h后，進行克隆形成實驗檢測各組細胞放射敏感性的變化。MCF-7細胞轉(zhuǎn)染pshRNA-UBE2D3和陰性對照組pshRNANC后，采用線性二次模型擬合照射后細胞的存活曲線，計算細胞的α值、β值以及SF2（2 Gy照射后細胞的存活分數(shù)）；SF2分別為0.6939、0.5838，UBE2D3可能參與MCF-7細胞放射敏感性的調(diào)節(jié)（見表1）。

表1 細胞的α值、β值以及SF2Tab.1 Values ofα，βand SF2 of cells

3 討論

基于泛素連接酶E3在泛素蛋白酶體系統(tǒng)中的底物特異性，目前關(guān)于泛素蛋白酶體系統(tǒng)的研究主要集中在泛素連接酶E3上，這些泛素連接酶E3主要包括BRCA1、RNF8、RNF168、Siah2、Mdm2、MKRN1、Chfr等。有研究發(fā)現(xiàn)泛素-蛋白酶體通路特異性阻斷劑MG-132對SGC-7901細胞有顯著抑制作用，同時端粒酶活性也相應(yīng)降低［4-6］；另外的研究組發(fā)現(xiàn)MKRN1蛋白可標記需要降解的hTERT，并通過促進hTERT的降解導(dǎo)致端粒酶活性降低［11］；另外乳腺癌相關(guān)基因BRCA1能夠下調(diào)c-myc的活性［7-9］，還能夠與c-myc結(jié)合，從而抑制c-myc對hTERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［10-11］，BRCA1基因敲除導(dǎo)致hTERT表達增加，端粒酶活性增強，端粒長度延長。此外，近來有研究者發(fā)現(xiàn)Hdm2作為一種泛素E3連接酶，可使hTERT多泛素化從而抑制端粒酶的活性［12-14］。而本研究中，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選出與hTERT相互作用的蛋白泛素交聯(lián)酶UBE2D3，并初步研究證實2者之間的相互作用。由于UBE2D3與UBE2N都屬于泛素交聯(lián)酶E2家族成員，這是否意味著，UBE2D3在放射敏感性的調(diào)節(jié)中也具有重要意義。為此進行了相關(guān)的研究。研究表明，抑制UBE2D3的表達可以加速MCF-7細胞G1期向S期的進程，增加MCF-7細胞的增殖，進一步通過Western blot檢測研究發(fā)現(xiàn)，抑制UBE2D3的表達能上調(diào)Cyclin D1的表達，進而解釋了細胞周期、增殖變化的原因。

與此同時，通過抑制UBE2D3的表達，可以上調(diào)hTERT的表達，增加MCF-7細胞的端粒酶活性。雖然對射線影響端粒酶活性存在不同的看法，前期的研究發(fā)現(xiàn)射線能誘導(dǎo)端粒酶活性增加。另外，也有研究顯示，hTERT的上調(diào)與端粒酶活性、細胞增殖存在正相關(guān)，上調(diào)hTERT的表達能上調(diào)Cyclin D1的表達［15］。但是過表達UBE2D3后，并沒有檢測到hTERT蛋白水平的變化，因此猜測，hTERT可能是UBE2D3的靶蛋白，hTERT的降解可能是通過泛素化修飾完成，但UBE2D3存在與之對應(yīng)的E3連接酶，過表達UBE2D3并不能引起相應(yīng)具有底物特異性E3的增加，因此并不能引起hTERT蛋白表達的變化。發(fā)現(xiàn)，通過抑制UBE2D3的表達，乳腺癌MCF-7細胞的放射敏感性降低。放射敏感的降低歸因于端粒酶活性的增加以及Cyclin D1的增加。干擾UBE2D3能上調(diào)hTERT以及Cyclin D1的表達，同時增加端粒酶的活性，干擾UBE2D3聯(lián)合放療，相對于單純干擾組，端粒酶活性明顯增加。綜上所述，研究成果顯示，除端粒酶-直接端粒延伸途徑可以成為放射增敏的靶點之外，端粒酶介導(dǎo)的非直接端粒延伸途徑，即端粒酶-泛素交聯(lián)酶-端粒調(diào)控通路，可能成為以后放射增敏研究的發(fā)展方向，為以后腫瘤細胞放射敏感性調(diào)控的研究及發(fā)展新的放射增敏／放射防護靶點提供思路。

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（編校：譚玲，秦曉英）

Effect of UBE2D3 in regulation of radiosensitivity in human breast cancer MCF-7 cell

ZHU Qiang1，WANG Pi-lin1，ZHANG Tie1，YIN Zi-yi1，QU Geng-bao1，YIN Yong-mei2

（1.Department of Mammary Gland，Beijing Tiantan Hospital Affiliated Capital Medical University，Beijing 100050，China；2.Department of Mammary Gland，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo explore the role of UBE2D3 in hTERT-mediated radiosensitivity in MCF-7 cells.MethodsBased on UBE2D3 gene sequences，three interference sequence were designed and a optimal jamming efficiency sequence was selected to synthesize pshRNA-UBE2D3.In MCF-7 cells，pEGFP-UBE2D3 and pshRNA-UBE2D3 were transfected respectively，and the influence of UBE2D3 on hTERT protein expression was detected by Western blot.Through transfection of pEGFP-hTERT，the influence of hTERT protein expression on UBE2D3 was detected by Western blot. UBE2D3 expression was dampened by pshRNA-UBE2D3 transfection，telomerase activity was detected by PCR-ELISA，the change of MCF-7 cell cycle was detected by MTT，MCF-7 cell proliferation was detected by CCK-8 and the change of MCF-7 cellular radiosensitivity was detected by colony-forming assay.ResultsAn optimal jamming efficiency sequence was selected，which could significantly reduce the radiosensitivity of MCF-7 cell；UBE2D3 could participate in the regulation of hTERT radiosensitivity，inhibit UBE2D3 expression，up-regulate hTERT and Cyclin D1expression，increase the activity of hTERT，accelerate G1 turn to S phase，and improve the MCF-7 cell proliferation to reduce the MCF-7 cell radiosensitivity.However，overexpression of UBE2D3 failed to detect the expression differences of hTERT.Conclusion UBE2D3 is inhibited by up-regulating hTERT and Cyclin D1expression to participate in the regulation of hTERT radiosensitivity.

UBE2D3；radiosensitivity；protein interaction；breast cancer

R737.9

A

1005－1678（2014）08－0077－04

國家自然科學基金（81172503）

朱強，男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：乳腺疾病診療及乳腺癌綜合治療，E-mail：qch1821460072＠163.com。