三氮螯合單功能三核鉑（II）配合物的DNA結(jié)合及其抗腫瘤活性研究

黃晶，洪鳴

（1.武漢中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北武漢430014；2.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇南京210029）

三氮螯合單功能三核鉑（II）配合物的DNA結(jié)合及其抗腫瘤活性研究

黃晶1，洪鳴2

（1.武漢中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北武漢430014；2.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇南京210029）

目的本論文以多核螯合Pt（II）抗腫瘤金屬配合物為中心，重點(diǎn)開(kāi)展了三氮螯合單功能三核鉑（II）配合物的DNA結(jié)合及其抗腫瘤活性的研究工作。方法將30μM配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與0.09 mM的5′-GMP溶解在水中，37℃條件下孵化24 h，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到2 h和24 h時(shí)，取出反應(yīng)液，利用電噴霧質(zhì)譜方法檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物；配制不同濃度比rb（drug-to-nucleotide ratio）的配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（I）和配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（II）與pUC19質(zhì)粒DNA（200 ng）的反應(yīng)液，37℃下避光孵化12 h，然后在1×TAE buffer（40mM Tris acetate，1mM EDTA）中，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析其在電泳中的遷移情況；配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和II的體外細(xì)胞毒活性用白血病細(xì)胞株（HL-60）、肺癌細(xì)胞株（A-549）和肝癌細(xì)胞株（BEL-7402）進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果電噴霧質(zhì)譜方法檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）極易與5′-GMP快速反應(yīng)，形成單加合物、雙加合物以及三加合物，表明I與5′-GMP較強(qiáng)的結(jié)合能力；凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）、II的rb值分別為0.099和0.66，配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）使DNA完全解旋所需濃度大大低于配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）；體外細(xì)胞毒活性測(cè)試，從測(cè)試結(jié)果來(lái)看，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）在濃度10－4M保持了較高的抗腫瘤活性，但是在10－5～10－8M范圍內(nèi)，I、II和順鉑對(duì)此細(xì)胞株幾乎全無(wú)毒性，抑制率全部低于40%。結(jié)論三氮螯合單功能三核鉑（II）配合物的DNA結(jié)合對(duì)提高藥物在生物內(nèi)的穩(wěn)定性和降低不良反應(yīng)有利。

抗癌藥物；DNA；鉑

隨著鉑類(lèi)抗癌藥物臨床使用的推廣，出現(xiàn)了許多難以克服的缺點(diǎn)，如腎毒性、神經(jīng)毒性、肝毒性、耳毒性和骨髓毒性等，并且還存在抗藥性問(wèn)題［1-3］，這些都嚴(yán)重影響患者的治療效果和生活質(zhì)量，成為目前亟待解決的問(wèn)題。Pt3-L與谷胱甘肽（GSH）的反應(yīng)研究表明，配合物與GSH形成單取代和雙取代產(chǎn)物，反應(yīng)過(guò)程中整個(gè)骨架保持完整，這對(duì)提高藥物在生物內(nèi)的穩(wěn)定性和降低不良反應(yīng)有利［4-7］。GSH與配合物作用的質(zhì)譜動(dòng)力學(xué)顯示，Pt-S之間較強(qiáng)的結(jié)合能力導(dǎo)致柔性大的配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）快速與GSH結(jié)合，并導(dǎo)致配合物發(fā)生分解；由于配體L2的空間位阻限制反應(yīng)速度，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）與GSH形成加合物較慢，并且在形成加合物的過(guò)程中，鉑配合物的結(jié)構(gòu)骨架沒(méi)有發(fā)生變化，這有利于提高其在生物體內(nèi)的利用度和減少不良反應(yīng)［8-10］。這些結(jié)果對(duì)進(jìn)一步了解多核鉑類(lèi)抗癌藥物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系非常重要，并且可為今后合理設(shè)計(jì)具有高生物活性的多核螯合鉑類(lèi)配合物提供指導(dǎo)作用。為此，本論文以多核螯合Pt（II）抗腫瘤金屬配合物為中心，重點(diǎn)開(kāi)展了三氮螯合單功能三核鉑（II）配合物的DNA結(jié)合及其抗腫瘤活性的研究工作。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 甲醇、氯仿、無(wú)水乙醚、丙酮、DMSO等常用溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，使用前未經(jīng)純化。對(duì)甲基苯腈購(gòu)自TCI；K2［PtCl4］、2-氯甲基吡啶鹽酸鹽、三（2-氨基乙基）胺、2-氯甲基吡啶、2-氨甲基吡啶、2，4，6-三（4-溴甲基苯基）-1，3，5-三嗪和二異丙基乙基胺均購(gòu)自阿拉??；NBS、偶氮二異丁腈（AIBN）和三氟甲磺酸購(gòu)自國(guó)藥。pUC19質(zhì)粒DNA購(gòu)自大連寶生物有限公司，小牛胸腺DNA（CT-DNA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓（EB）購(gòu)自sigma。試驗(yàn)中使用的水milli-Q為超純水。質(zhì)譜使用了LCQ電噴霧質(zhì)譜儀（ESMS，Thermo Scientific），用于擬合質(zhì)譜峰同位素分布方式的軟件為Isopro 3.0。

1.2 方法

1.2.1 配合物與5′-GMP的反應(yīng)：將30μM配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與0.09mM的5′-GMP溶解在水中，37℃條件下孵化24 h，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到2 h和24 h時(shí)，取出反應(yīng)液，利用電噴霧質(zhì)譜方法檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物（見(jiàn)圖1）。

圖1 配合物［Pt3 L1Cl3］Cl3（I）與5′-GMP的反應(yīng)歷程Fig.1 Reaction mechanism of complexes Iand 5′-GMP

1.2.2 配合物與質(zhì)粒DNA的解旋作用：配制不同濃度比rb（drug-to-nucleotide ratio）的配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和II與pUC19質(zhì)粒DNA（200 ng）的反應(yīng)液，37℃下避光孵化12 h，然后在1×TAE buffer（40mM Tris acetate，1mM EDTA）中，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析其在電泳中的遷移情況。100 V電壓下進(jìn)行2 h后用0.5μg／mLEB染色，最后用UVP凝膠成像系統(tǒng)完成電泳圖的成像。

1.2.3 配合物的體外細(xì)胞毒活性檢測(cè)［11］：配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）的體外細(xì)胞毒活性用白血病細(xì)胞株（HL-60）、肺癌細(xì)胞株（A-549）和肝癌細(xì)胞株（BEL-7402）進(jìn)行測(cè)試。腫瘤細(xì)胞在添加了10%（v／v）熱失活的胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100 U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為310 K下高濕度的95%空氣和5%CO2。配合物對(duì)A-549和BEL-7402細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制活性用磺酰羅丹明B蛋白染色法（sulforhodamine B，SRB）測(cè)試。向96孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔接種100μL粘附腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基，在加入藥物前使其粘附24 h。配合物對(duì)HL-60細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制活性用MTT［3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）－2，5-二苯基溴化四唑］測(cè)定。具體步驟：向96孔培養(yǎng)板的每個(gè)空井中接種100μL從指數(shù)生長(zhǎng)期采集的細(xì)胞（含在培養(yǎng)基中），然后按濃度梯度加入待研究的化合物，使最終形成的濃度分別為1×10－4、1×10－5、1× 10－6、1×10－7、1×10－8M。培養(yǎng)板在310 K、含5%CO2的潮濕環(huán)境中孵化48 h，每個(gè)孔加入濃度為5mg／mL的MTT溶液40μL后再孵化4 h，然后加入100μL“3組份溶液”（10%SDS-5%異丁醇和12mM HCl）。培養(yǎng)板在37℃下溫育過(guò)夜，在分光光度計(jì)上測(cè)定540 nm波長(zhǎng)下溶液的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 5′-GMP結(jié)合性能的電噴霧質(zhì)譜研究 鉑類(lèi)抗癌藥物在人體內(nèi)的主要進(jìn)攻靶點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)的DNA，鉑類(lèi)藥物與DNA結(jié)合后抑制DNA的復(fù)制而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療效果［12］。當(dāng)配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與5′-GMP在37℃下混合反應(yīng)2 h的時(shí)候，出現(xiàn)的2個(gè)正離子峰854.83和999.92，分別歸屬為［Pt3LL1Cl2＋GMP］2＋（Pt3C52H60N15O8CCl2P）和［Pt3L1＋2GMP］2＋（Pt3C62H72N20O16P2）。配合物與GMP形成單加合物與雙加合物，以單加合物為主。558.33和667.00分別是單加合物與雙加合物的三電荷峰，可歸屬［Pt3L1Cl＋GMP］3＋（Pt3C52H60N15O8ClP）和［Pt3L1＋2GMPP＋H］3＋（Pt3C62H73N20O16P2）反應(yīng)進(jìn)行24 h后，配合物與2個(gè)GPM形成的雙加合物的峰增強(qiáng)，單加合物的峰明顯下降，同時(shí)出現(xiàn)的新峰517.33是雙加合物的四電荷峰，1181.75為配合物與GMP的三加合物的雙電荷峰，可分別歸屬為［Pt＋3L1＋2GMP＋Na＋2H＋C2H3OH］4＋（Pt3C64H73N20O17P2Na）和［Pt3L1＋3GMP＋2H］2＋（Pt3C72H86N25O24P3）。這說(shuō)明了反應(yīng)進(jìn)行24 h后，配合物與1個(gè)GMP形成的加合物少量存在，有一定量的配合物與GMP的三加合物出現(xiàn)，配合物與2個(gè)GMP形成的加合物成為主要產(chǎn)物存在于溶液中（見(jiàn)圖2）。

圖2 配合物［Pt3 L1Cl3］Cl3（I）與5′-GMP 37℃下反應(yīng)2、24 h的電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）Fig.2 Electrospraymass spectrometry（ESI-MS）results of complexes I reactive with 5′-GMP for 2 h，24 h under 37℃

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）極易與5′-GMP快速反應(yīng)，形成單加合物、雙加合物以及三加合物，表明了配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與5′-GMP較強(qiáng)的結(jié)合能力。

2.2 凝膠電泳研究配合物與DNA的結(jié)合 凝膠電泳方法是研究配合物對(duì)DNA解旋能力強(qiáng)弱最有效與直接的方法［13］。把這一配合物與核苷酸濃度比值定義為rb對(duì)應(yīng)于完全解除DNA的超螺旋形式所需的鉑配合物的量。如下圖3所示，實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）、II的rb值分別為0.099和0.66，配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）使DNA完全解旋旋所需濃度遠(yuǎn)低于配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)高濃度的配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）會(huì)使部分DNA沉降，這可能是由于配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）的剛性結(jié)構(gòu)以及＋3價(jià)電荷的陽(yáng)離子與負(fù)電荷的的DNA骨架結(jié)合所導(dǎo)致。配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）引起部分DNA沉降導(dǎo)致了配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）的的解旋能力小于I。

配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）（A）、配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）（B）與pUC19質(zhì)粒DNA在37℃溫育12 h的凝膠電泳圖見(jiàn)圖3，其中Lane 1為DNA空白；Lane 2～10（a）的rb值分別為0.033，0.066，0.099，0.132，0.165，0.198，0.231，0.264，0.297；Lane 2～10（b）的rb值分別0.33，0.4125，0.495，0.5775，0.66，0.7425，00.825，0.90775，0.99。

圖3 2種配合物凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis analysis of two compounds

2.3 配合物與GSH結(jié)合的電噴霧質(zhì)譜表征 本研究利用電噴霧質(zhì)譜跟蹤谷胱甘肽（GSH）與配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）、配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）反應(yīng)產(chǎn)物及反應(yīng)速度，從而判斷配合物與GSH的作用活性［14］。

配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與GSH反應(yīng)進(jìn)行到2 h時(shí)，配合物本身的質(zhì)譜峰全部消失，說(shuō)明I與GSH反應(yīng)較快。3個(gè)新峰372.58，577.17和1189.00分別歸屬為［Pt2＋2BPA＋GSH＋Na-2H］3＋（Pt2C34H43N9O6SNa），［Pt2＋2BPA＋GSH＋Cl＋Na-2H］2＋（Pt2C34H43N9O6SClNa）和［Pt2＋2BPA＋GSH＋2Cl＋Na-2H］＋（Pt2C34H43N9O6SCl2Na）。配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與GSH結(jié)合發(fā)生了分解，3個(gè)BPA鉑（II）中心全部與橋連基團(tuán)分離，而GSH上的S原子分別與2個(gè)獨(dú)立的Pt（BPA）配位（見(jiàn)圖4）。這種由于與GSH結(jié)合而引起配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）的分解與Farrell小組報(bào)道的經(jīng)典多核鉑配合物BBR3464的分解類(lèi)似，與鉑原子配位的N和其相連的柔性鏈上的C原子間的共價(jià)鍵斷裂，導(dǎo)致配合物分解。反應(yīng)進(jìn)行到24 h，主要的質(zhì)譜峰沒(méi)有發(fā)生改變；溶液中的主要物質(zhì)還是GSH結(jié)合2個(gè)Pt（BPA）。

圖4 配合物［Pt3 L1Cl3］Cl3（I）與5′-GMP 37℃下反應(yīng)2、24 h的電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）Fig.4 Reaction of［Pt3 L1Cl3］Cl3（I）and 5′-GMP for 2 h，24 h，37℃detected by ESI-MS

配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）和GSH反應(yīng)的結(jié)果與配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）不同。當(dāng)配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）與GSH孵化2 h，檢測(cè)溶液的正離子峰主要是配合物的離子峰，而出現(xiàn)的1個(gè)較弱的新的正離子峰952.33，是配合物與GSH形成的1個(gè)單加合物，可歸屬為［Pt3L2Cl2＋GSH-2H］2＋（Pt3C70H69N15O6Cl2S）。反應(yīng)到24 h，雖然Ⅱ與GSH的單加合物峰繼續(xù)增加，但是配合物本身峰的強(qiáng)度依然很大，說(shuō)明反應(yīng)消耗的反應(yīng)物較少（見(jiàn)圖5）。

圖5 配合物［Pt3 L2Cl3］Cl3（II）與GSH 37℃下反應(yīng)2、24 h的電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）Fig.5 Reaction of［Pt3 L2Cl3］Cl3（II）and 5′-GMP for 2 h，24 h，37℃detected by ESI-MS

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與GSH反應(yīng)速度較快，并且由于與GSH結(jié)合導(dǎo)致配合物的分解，這與連接3個(gè)BPA鉑中心的基團(tuán)柔性太大有關(guān)系，當(dāng)S與鉑配位后而致使化學(xué)鍵斷裂，配合物分解。雖然Pt-S之間有較強(qiáng)的結(jié)合能力，由于配體L2的空間位阻作用，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）與GSH反應(yīng)速度較慢。因?yàn)榕浜衔铮跴t3L2Cl3］Cl3（II）骨架結(jié)構(gòu)的剛性強(qiáng)于配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I），形成了加合物，配合物的骨架依然保持完整，沒(méi)有因?yàn)镾與鉑配位而致使配合物分解。

2.4 體外細(xì)胞毒活性測(cè)試 配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）的體外細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)選用白血病細(xì)胞株（HL-60），肺癌細(xì)胞株（A-549）和肝癌細(xì)胞株（BEL-740）進(jìn)行了測(cè)定［15］。對(duì)于肺癌細(xì)胞株，配合物在所檢測(cè)的范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的抑制率都高于順鉑（見(jiàn)圖6）。

圖6 12細(xì)胞毒活性圖Fig.6 Cytotoxic activity diagrams

從測(cè)試結(jié)果來(lái)看，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）在濃度10－4M保持了較高的抗腫瘤活性，但是在10－5～10－8M范圍內(nèi)，配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）、配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）和順鉑對(duì)此細(xì)胞株幾乎全無(wú)毒性，抑制率全部低于 40%。順鉑、配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）、配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）對(duì)肝癌細(xì)胞株的作用結(jié)果顯示與肺癌細(xì)胞株類(lèi)似的結(jié)果。配合物作用于白血病細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)中，在10－4M濃度，順鉑對(duì)細(xì)胞的抑制率高于配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II），濃度降低后，配合物與順鉑對(duì)細(xì)胞的抑制率降幅較大，表現(xiàn)出較低的毒活性?？偟膩?lái)說(shuō)，對(duì)于A-549和BEL-7402細(xì)胞株，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）表現(xiàn)出比I和順鉑更好的細(xì)胞毒活性。

3 討論

本文選用柔性的三乙胺和剛性的2，4，6-三（4-甲基苯）-1，3，5-三嗪橋連3個(gè)Pt-BPA配位基團(tuán)合成了2個(gè)三氮螯合單功能三核鉑（II）配合物。凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）的解旋能力強(qiáng)于配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II），這是由于配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）容易引起DNA沉降所致。此外，這些配合物的DNA結(jié)合能力又與其抗腫瘤活性有著內(nèi)在聯(lián)系。體外細(xì)胞毒活性研究表明，對(duì)于A-549和BEL-7402細(xì)胞株，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）表現(xiàn)出比配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和順鉑更好的細(xì)胞毒活性，但是總體抗腫瘤活性較低。GSH與配合物作用的質(zhì)譜動(dòng)力學(xué)顯示，Pt-S之間較強(qiáng)的結(jié)合能力導(dǎo)致柔性大的配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）快速與GSH結(jié)合，并導(dǎo)致配合物發(fā)生分解；由于配體L2的空間位阻限制反應(yīng)速度，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）與GSH形成加合物較慢，并且在形成加合物的過(guò)程中，鉑配合物的結(jié)構(gòu)骨架沒(méi)有發(fā)生變化，這有利于提高其在生物體內(nèi)的利用度和減少不良反應(yīng)。這些結(jié)果對(duì)進(jìn)一步了解多核鉑類(lèi)抗癌藥物的結(jié)構(gòu)－活性關(guān)系非常重要，并且可為今后合理設(shè)計(jì)具有高生物活性的多核螯合鉑類(lèi)配合物提供指導(dǎo)作用。

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（編校：吳茜，王儼儼）

Study on three single-function of three nuclear nitrogen chelating p latinum（II）com p lex DNA conjugates and its anti-tumor activity

HUANG Jing1，HONGMing2

（1.Department of Respiratory Medicine，Wuhan Central Hospital，Wuhan 430014，China；2.Department of Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the conjugate ofmulticore chelating Pt（II）anti-tumormetal complexes and focus on the following research work.Methods30μM complexes Iand 0.09 mM 5′-GMPwere dissolved in water，and incubated for 24 h under the condition of 37℃.When the reaction was carried out for2 h and 24 h，the reaction solution was removed and reaction productswere detected by electrospray ionizationmass spectrometry；the reaction liquids of Iand IIand pUC19 plasmid DNA（200 ng）were prepared at different concentrations（drug-to-nucleotide ratio）and were incubated for 12 h in dark，37℃，and then themigration in capillary electrophoresiswas analyzed by 1%agarose gelelectrophoresis in 1×TAE buffer（40mM Tris acetate，1mM EDTA）；cytotoxicity of complexes Iand II in vitrowas tested by human leukemia cell line（HL-60），lung cancer cell line（A-549）and hepatocellular carcinoma cell line（BEL-7402）.ResultsElectrospray ionization mass spectrometry method for the detection of reaction product showed that complexes of Iand 5′-GMP responsed quickly and adduct of single，double adduct and three adducts formated，which showed I and 5′-GMP had strong binding ability；Rb values of I，IIwere 0.099 and 0.66 determinated by gel electrophoresis，and complexes I concentration of DNA unwinding was considerably less than complex II；the in vitro cytotoxicity test results showed，the complex II maintained higher antitumor activity in the concentration of10－4M，but I，IIand cisplatin were almost all non-toxic for this cell line in the 10－5～10－8M range，and inhibition rateswere lower than 40%.Conclusion Three single function of three nuclear nitrogen chelating platinum（II）complex DNA conjugates could improve stability of drugs in vivo and reduce the adverse reactions.

anti-tumor drugs；DNA；platinum

R96

A

1005－1678（2014）08－0065－05

國(guó)家自然科學(xué)基金（81100352）

黃晶，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：肺部感染，肺部腫瘤，E-mail：qch1821460038＠163.com。