不同濃度人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的影響

王偉，黃坤，鄭雷蕾

（1.銀川市第一人民醫(yī)院骨二科，寧夏銀川750002；2.江蘇省南通市海門(mén)人民醫(yī)院骨科，江蘇南通226000；3.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，重慶400046）

不同濃度人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的影響

王偉1，黃坤2，鄭雷蕾3

（1.銀川市第一人民醫(yī)院骨二科，寧夏銀川750002；2.江蘇省南通市海門(mén)人民醫(yī)院骨科，江蘇南通226000；3.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，重慶400046）

目的觀察人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化的影響。方法選取出生24 h之內(nèi)的SD乳鼠10只，提取分離成骨細(xì)胞，并經(jīng)細(xì)胞形態(tài)觀察、堿性磷酸酶活性化學(xué)染色法以及Giemsa染色法鑒定。根據(jù)加入不同濃度的人參皂苷Rb1將成骨細(xì)胞分為0、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L 5組；采用CCK-8法檢測(cè)加藥24、48、72 h后對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響；采用PNPP法檢測(cè)成骨細(xì)胞中ALP活性，分析不同濃度的人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響；Real-Time PCR法檢測(cè)增殖標(biāo)記基因PCNA、Ki67和分化標(biāo)記基因COL1、BGP的表達(dá)水平。結(jié)果成功分離獲得成骨細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定和染色結(jié)果顯示細(xì)胞滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示：與0mol／L組相比，人參皂苷Rb1不同濃度組對(duì)成骨細(xì)胞均有不同程度的促進(jìn)增殖作用（P＜0.05，P＜0.001）；堿性磷酸酶（ALP）比活性檢測(cè)結(jié)果顯示：與0mol／L組相比，人參皂苷Rb1 10－7、10－6、10－5mol／L濃度組分別培養(yǎng)3、5、7 d后，及10－8mol／L培養(yǎng)7 d后，成骨細(xì)胞活性均有顯著升高（P＜0.05，P＜0.001），最佳效果濃度組為10－6mol／L；Real-Time PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示：與0mol／L組相比，人參皂苷Rb1 10－7、10－6、10－5mol／L各濃度組均能顯著提高成骨細(xì)胞PCNA、Ki67、BGP、COL1 mRNA表達(dá)水平，10－8mol／L可顯著提高COL1mRNA表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001），其中以10－6mol／L濃度組效果最佳。結(jié)論不同濃度（10－8、10－7、10－6、10－5mol／L）人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化具有明顯促進(jìn)作用。

人參；人參皂苷Rb1；成骨細(xì)胞；增殖；分化

骨質(zhì)疏松癥是隨著現(xiàn)代影像醫(yī)學(xué)的發(fā)展應(yīng)用而得以認(rèn)識(shí)的一種新疾病，它以骨量減少伴骨組織結(jié)構(gòu)退化為特征，從而導(dǎo)致骨的脆性增高，增加骨折的危險(xiǎn)性。骨質(zhì)疏松癥是一種全身代謝性骨骼疾病。中醫(yī)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥的病因病機(jī)涉及多個(gè)臟腑，主要以腎虛為本、脾虛為本以及腎脾俱虛為本占主導(dǎo)［1］。人參為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津止渴、安神益智之效。人參的有效成分較多，其中人參皂苷Rb1為活性較強(qiáng)的人參二醇類(lèi)。前期有研究表明人參水煎液或人參皂苷Rb1對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療具有一定的療效［2-3］。但關(guān)于人參治療骨質(zhì)疏松的有效部分，以及其作用機(jī)制仍不明了，使臨床上應(yīng)用人參治療骨質(zhì)疏松癥缺乏實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)，因此本研究旨在觀察人參皂苷Rb1對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞增殖分化的影響，從而探討人參治療骨質(zhì)疏松的有效成分，為人參皂苷Rb1作用于骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究以及臨床研究提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24 h之內(nèi)的SD乳鼠10只，SPF級(jí)，雌雄各半，購(gòu)自武漢疾病預(yù)防控制中心，合格證號(hào)：SCXK（鄂）2005-0005。

1.1.2 主要試劑 人參皂苷Rb1（中國(guó)藥品生物制品檢定所），DMEM培養(yǎng)基、瓊脂糖、0.1%Ⅱ膠原酶、0.25%胰蛋白酶（Gbico公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），Real-Time PCR試劑盒（Thermo Scientific）。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Heal Forse，HF240），低溫高速離心機(jī)（Sigma公司，RS-28），倒置顯微鏡（Olypus XDS-1B型），酶標(biāo)儀（Multiskan GO），實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad CF× 96），核酸蛋白分析儀（BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)、純化、傳代［4］取出生24 h內(nèi)新生SD乳鼠10只，不分雌雄，不計(jì)體質(zhì)量。在無(wú)菌條件下剝?nèi)∪槭蟮娘B蓋骨，立即置于預(yù)冷的PBS液中，剔除結(jié)締組織。用PBS液清洗3次，將其置于盛有DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌小剪剪成小碎塊大小，0.5 mm×0.5 mm左右，加入5 mL 0.25%的胰蛋白酶，立即置于孵育箱中消化20min。加適量血清終止消化，棄去上清液，加入10mL的0.1%Ⅱ膠原酶，于孵育箱中消化90min。1000 r／min低溫離心10min，棄上清，PBS洗滌沉淀3次，200目濾網(wǎng)過(guò)濾除去骨碎片，用DMEM混合培養(yǎng)液（含10%的胎牛血清、100 mg／L鏈霉素、100 U／mL青霉素）重懸細(xì)胞，吹打均勻后接種于培養(yǎng)瓶中。于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。48 h后換液1次，以后隔天換液1次。至細(xì)胞融合成單層，密度為80%時(shí)，以1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第2代以后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 成骨細(xì)胞鑒定 ①細(xì)胞形態(tài)觀察：用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化以及生長(zhǎng)狀況并拍照。②堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞化學(xué)染色：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2代成骨細(xì)胞，按體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇固定30min后，嚴(yán)格按照堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒要求進(jìn)行檢測(cè)。③Giemsa染色：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2代成骨細(xì)胞，甲醇固定10min，Giemsa染色2min，蒸餾水沖洗，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 成骨細(xì)胞增殖檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成骨細(xì)胞按3.5×104個(gè)／mL接種于96孔培養(yǎng)板中，24 h后用培養(yǎng)基進(jìn)行同步消化24 h，分別加入濃度為0、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L的人參皂苷Rb1培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于加藥24、48、72 h后，每孔加入CCK-8檢測(cè)液10μL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，于450nm波長(zhǎng)處，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔光密度值（OD值）。

1.2.4 堿性磷酸酶（ALP）比活性檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成骨細(xì)胞按5.0×104個(gè)／mL接種于24孔培養(yǎng)板，24 h換液1次，分別按濃度為0、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L、加入人參皂苷Rb1培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)3、5、7 d后，嚴(yán)格按照堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)ALP活性。

1.2.5 Real-Time PCR法檢測(cè)PCNA、Ki67、COL1、BGP mRNA表達(dá)水平 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成骨細(xì)胞按1.0×105個(gè)／mL接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，分別按濃度為0、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L加入人參皂苷Rb1培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。嚴(yán)格按照Real-Time PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，實(shí)時(shí)定量PCR儀擴(kuò)增檢測(cè)。所有引物均由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成。Real-Time PCR引物序列分別為：PCNA：上游：5′-TGGAATCCCAGAACAGGAG-3′，下游：5′-CCAATGTGGCTAAGGTCTCG-3′；Ki67：上游：5′-AAGGAACCATCAAGGCGAG-3′，下游：5′-ATCTGAGGCAGGGCTATCTG-3′；上游：5′-TGACTGGAAGAGCGGAGAGT-3′，下游：5′-AGTAGACCTTGATGGCGTCC-3′；上游：5′-GGACCATCTTTCTGCTCACTC-3′，下游：5′-CCAATGTGGCTAAGGTCTCG-3′；實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2－△△CT法計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞鑒定 倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)成骨細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)，多呈梭形和或多角形，細(xì)胞伸展，有長(zhǎng)短不一的突起，偶可見(jiàn)突起相互連接呈網(wǎng)狀或鋪路石樣排列緊密，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)（見(jiàn)圖1A）；堿性磷酸酶活性化學(xué)染色結(jié)果可見(jiàn)大量陽(yáng)性細(xì)胞，其細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)顆粒呈藍(lán)黑色顆粒（見(jiàn)圖1B）；Giemsa染色結(jié)果可見(jiàn)呈三角形或梭形的成骨細(xì)胞胞漿豐富、呈藍(lán)紫色，細(xì)胞核被染成深藍(lán)色，核仁明顯，位于細(xì)胞中（見(jiàn)圖1C）。

圖1 成骨細(xì)胞鑒定Fig.1 Identification of osteoblasts

2.2 成骨細(xì)胞增殖檢測(cè) 由表1可見(jiàn)，加入人參皂苷Rb1培養(yǎng)液24、48、72 h后，CCK-8試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，各濃度組對(duì)成骨細(xì)胞的增殖均有明顯地促進(jìn)作用，并呈一定時(shí)間濃度依賴(lài)性，最佳效果濃度組為10－6mol／L。

表1 人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞的增殖的影響（n＝9）Tab.1 Effect of ginsenosides Rb1 on osteoblast proliferation（n＝9）

2.3 成骨細(xì)胞分化檢測(cè) 由表2檢測(cè)結(jié)果可知，除10－8mol／L組3、5 d外，其他各組加入人參皂苷Rb1培養(yǎng)液后，分別培養(yǎng)3、5、7 d，堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)成骨細(xì)胞活性均顯著增加（P＜0.05，P＜0.001），并呈一定時(shí)間濃度依賴(lài)性，最佳效果濃度組為10－6mol／L。

表2 人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞的分化的影響（n＝9）Tab.2 Ginsenosides Rb1 effects on osteoblast differentiation（n＝9）

2.4 Real-Time PCR法檢測(cè)PCNA、Ki67、COL1、BGPmRNA表達(dá)水平 由表3可見(jiàn)，與0 mol／L組相比，各濃度人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞PCNA、Ki67、COL1、BGPmRNA表達(dá)水平均有不同程度的增加，除10－8mol／L組的PCNA、Ki67、BGPmRNA，其他各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.001），其中濃度組為10－6mol／L效果最佳。

表3 人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞PCNA、Ki67、COL1、BGPmRNA表達(dá)水平的影響（n＝9）Tab.3 Effect of ginsenosides Rb1 on osteoblast PCNA，Ki67，COL1，BGPmRNA expression levels（n＝9）

3 討論

成骨細(xì)胞是來(lái)源于中胚層內(nèi)外骨間或骨髓基質(zhì)間的充質(zhì)干細(xì)胞，它具有多向分化潛能，其分化是骨形成的關(guān)鍵，能夠分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，并負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，在體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)解作用下分化形成骨祖細(xì)胞進(jìn)而形成前成骨細(xì)胞［5-7］。因此防治骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵之一就是促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨功能。中醫(yī)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥的基本病因是多因素導(dǎo)致的腎虛、骨枯髓減，其主要原因可能為腎虛又可能為脾虛、肝病、血瘀等。人參具有補(bǔ)五臟，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對(duì)肝病也有一定的治療作用［8-9］，其中人參皂苷Rb1為其主要有效成分。本文研究發(fā)現(xiàn)不同濃度人參皂苷Rb1（10－8、10－7、10－6、10－5mol／L）對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化具有不同程度的促進(jìn)作用，這可能跟人參補(bǔ)五臟，治療脾虛等癥有關(guān)。

PCNA是Miyachi等于1978年發(fā)現(xiàn)鑒別的，它是一種細(xì)胞周期調(diào)解蛋白，其活性直接反應(yīng)細(xì)胞增值活性，是理想的細(xì)胞增殖標(biāo)記物［10-12］。而Ki67則是一種細(xì)胞核抗原，僅僅在增殖細(xì)胞核中表達(dá)，它可快速識(shí)別正在增殖分裂的成骨細(xì)胞［13-14］。在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，ALP是一種較為肯定的早期指標(biāo)，隨著細(xì)胞的分化其表達(dá)和分泌會(huì)隨之增強(qiáng)，ALP活性越強(qiáng)表明成骨細(xì)胞骨形成的狀況越好［15］。COLI是成骨細(xì)胞向基質(zhì)成熟方向分化的標(biāo)志，是鈣鹽沉著以及細(xì)胞附著的支架，它的合成分泌是骨組織形成的先決條件［16］。BGP在抑制成骨細(xì)胞生長(zhǎng)軟骨礦化的速度時(shí)起著重要的調(diào)節(jié)作用，它是有成骨細(xì)胞特異合成和分泌的一種非膠原蛋白，只會(huì)在礦化期才會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)［17］。治療骨質(zhì)疏松癥的藥物多具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化的作用。本研究觀察Real-Time PCR法檢測(cè)增殖標(biāo)記基因PCNA以及Ki67的mRNA以及分化標(biāo)記基因COL1、BGPmRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與0mol／L組相比，10－7、10－6、10－5mol／L各濃度組均能顯著提高成骨細(xì)胞PCNA、Ki67、BGP、COL1 mRNA表達(dá)水平，10－8mol／L可顯著提高COL1 mRNA表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001），其中濃度組以10－6mol／L效果最佳。這一結(jié)果提示人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化的作用，可能是通過(guò)上調(diào)增殖標(biāo)記基因PCNA、Ki67以及COL1、BGP分化標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)水平有關(guān)。這與王俊俊等的研究結(jié)果相似［3］。

綜上所述，人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化均具有不同程度的影響，為人參皂苷Rb1作用于骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究以及臨床研究提供了科學(xué)依據(jù)，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，本研究只觀察了人參皂苷Rb1對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化的影響，并未觀察對(duì)破骨細(xì)胞的影響，因此后期研究則可從這2方面加以研究。

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（編校：吳茜）

Effect of different concentrations of ginseng saponin Rb1 on osteoblast proliferation and differentiation

WANGWei1，HUANG Kun2，ZHENG Lei-lei3

（1.Department of Orthopedics，F(xiàn)irst People's Hospital of Yinchuan City，Yinchuan 750002，China；2.Department of Orthopaedics，Jiangsu Province People's Hospital of Nantong Haimen，Nantong 226000，China；3.Department of Clinical Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing 400046，China）

ObjectiveTo observe the effects of ginseng saponin Rb1 on osteoblast proliferation and differentiation.Methods10 SD rats born within 24 h were separated and extracted for osteoblasts，the cellmorphologicalwere observed，and identified by alkaline phosphatase activity chemical dyeingmethod and Giemsa stainingmethod.Osteoblastswere divided into 0，10－8，10－7，10－6，10－5mol／L groups according to different concentration of ginsenosides Rb1，and CCK 8 method was used to detect osteoblast proliferation after incubation at24，48，72 h；PNPPmethod was used to detect the osteoblast ALP activity；Real-Time PCR method was used to detect the proliferation marker gene mRNA expression of PCNA and Ki67 and differentiation marker gene expression of COL1 and BGP.ResultsOsteoblastwere obtained and indentified，the qualitymet the subsequentexperimental requirements.CCK 8 test results showed that：compared with 0mol／L group，ginsenosides Rb1 groups of different concentrations promoted osteoblast proliferation in some degree（P＜0.05，P＜0.001）.Alkaline phosphatase（ALP）activity test results showed that：compared with 0 mol／L group，osteoblasts ALP activity of 10－7，10－6，10－5mol／L ginsenosides Rb1 groups at3，5，7 h and 10－8mol／L at7 d were significantly increased（P＜0.05，P＜0.001），and the best effect of concentration of 10－6mol／L.Real-Time PCR results showed that compared with 0 mol／L group，10－7，10－6，10－5mol／L ginsenosides Rb1 group significantly increased the concentration of osteoblasts PCNA，Ki67，BGP，COL1 mRNA expression，10－8mol／L significantly increased COL1mRNA expression（P＜0.05，P＜0.001），ofwhich the effectof10－6mol／Lwas best.Conclusion Different concentrations（10－8，10－7，10－6，10－5mol／L）of ginseng saponin Rb1 can accelerate osteoblast proliferation and differentiation.

ginseng；ginsenosides Rb1；osteoblasts；proliferation；differentiation

王偉，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：骨與關(guān)節(jié)損傷與修復(fù)、矯形，E-mail：ww13895176182163.com。

R453.9

A

1005－1678（2014）08－0050－04

2009年博士點(diǎn)基金（20095503120006）