五味子木脂素對裸鼠膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響

金 宏 劉 威 溫 娜 紀朋艷 王 爽 齊 玲 劉曉陽

(吉林醫(yī)藥學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，吉林 吉林 132013)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤在顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率較高，目前治療方法主要以手術(shù)為主，輔以放化學治療，但都效果不佳，術(shù)后復發(fā)率、死亡率很高。其中位生存期<1年，且大多數(shù)患者在確診后 2 年內(nèi)死亡〔1〕。五味子作為補益類中藥，在護肝、提高免疫、抗腫瘤與抗氧化等方面已受到多項證實。研究表明，木脂素是五味子中主要生物活性成分〔2，3〕，但其對腦膠質(zhì)瘤中治療作用研究較少。本研究觀察了五味子木脂對體外培養(yǎng)裸鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生長的作用，旨在探討五味子木脂素在腦腫瘤細胞生長中起到的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑 細胞培養(yǎng)基RPMI-1640 (Thermo)，小牛血清(Gibco)，五味子木脂素(北華大學提供)，木瓜蛋白酶(北京鼎國)，四甲基耦氮唑藍(MTT)(Sigma)，二甲基亞砜(DMSO)(Thermo)。

1.2提取原代裸鼠膠質(zhì)瘤細胞 取新鮮的裸鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織，冰上操作，剔除壞死出血部分，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，將組織剪成1×1 mm2碎塊，置于離心管中，加入木瓜蛋白酶后將離心管置于37℃培養(yǎng)箱中，消化30 min，吸取上清液，加血清終止消化，以300 r/min離心5 min，棄上清后加培養(yǎng)液反復吹打，過濾后以300 r/min速度離心5 min，離心再次棄上清，加入含10%血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，臺盼藍計數(shù)活細胞，以2×106將細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)待用。

1.3培養(yǎng)裸鼠膠質(zhì)瘤細胞 將提取細胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入10 ml含10%小牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，將其置入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，待細胞匯合度為 80%～90% 時，用0.25%胰酶消化傳代，取傳3代以后對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.4藥物作用后膠質(zhì)瘤細胞生長情況 將五味子木脂素溶解后，取適量藥液加入含5%小牛血清RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，配制成終濃度為0、50、100、200 μg/ml的藥物。將裸鼠膠質(zhì)瘤細胞，用胰酶消化后，用含5%小牛血清RPMI-1640細胞培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。將細胞懸液均勻接種于96孔板中，100 μl/孔，置入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細胞同步化。分別于24、48、72 h棄去上清液，加入含不同濃度的五味子木脂素，每個藥物濃度重復5次。藥物作用結(jié)束時，每孔加入MTT 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止細胞培養(yǎng)，棄去上清液，每孔分別加DMSO 150 μl，震蕩均勻使MTT沉淀完全溶解，15 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值，用不加細胞的空白孔調(diào)零。

2 結(jié) 果

不同濃度五味子木脂素作用于裸鼠膠質(zhì)瘤細胞，結(jié)果顯示：隨著藥物濃度的增高，對膠質(zhì)瘤細胞的生長起到抑制作用，濃度在200 μg/ml時，對細胞的抑制作用最明顯(P<0.01)，說明五味子木脂素在高濃度時可以抑制膠質(zhì)瘤細胞生長。見表1。

表1 不同濃度五味子木脂素對裸鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的作用±s)

3 討 論

神經(jīng)上皮組織腫瘤在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率較高，同時分類及分型最多〔4〕。其中，又以膠質(zhì)細胞瘤為最多，約占 50%。目前，手術(shù)治療仍是腦膠質(zhì)瘤的主要治療手段，但是患者的生存期不高，一直維持在15～22個月〔5〕。所以，為了提高膠質(zhì)瘤患者的生存率，研究新的治療手段顯得十分迫切。近年來隨著祖國醫(yī)學的飛速發(fā)展，中醫(yī)中藥等治療方法已從逐漸過渡到臨床，并取得了一定治療效果，這些方法可有效縮小腫瘤體積、減少腫瘤血供，提高患者生存率。

五味子是我國長期使用的補益類藥物，大量研究證明，五味子中含有的聯(lián)苯環(huán)辛二烯結(jié)構(gòu)的木脂素類物質(zhì)是其主要的生物活性成分〔6～9〕，主要包括五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素等，此類物質(zhì)具有保肝、降酶、保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗艾滋病毒和抗癌等多種活性〔10～12〕。研究表明木脂素發(fā)揮抗腫瘤作用主要是通過清除氧自由基、誘導腫瘤細胞分化及凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多耐藥性、抑制腫瘤血管生成等機制來抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。目前對五味子木脂素在腦膠質(zhì)瘤細胞中是否發(fā)揮抑瘤作用還未見研究。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)較高濃度五味子木脂素作用裸鼠腦膠質(zhì)瘤細胞后，可以誘導腫瘤細胞死亡，對細胞生長具有明顯的抑制作用。藥物濃度在200 μg/ml時，對膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用最明顯。充分說明五味子木脂素在治療腦腫瘤中可能發(fā)揮重要作用。具體該藥通過何種途徑發(fā)揮抑瘤作用還有待進一步研究。

綜上所述，本實驗檢測到五味子木脂素在高濃度時可明顯抑制體外腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖，進一步肯定了五味子木脂素在抗腫瘤方面的應用價值。下一步，將在此研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探索五味子木脂素具體通過哪種方式發(fā)揮其抗腦膠質(zhì)瘤作用。

4 參考文獻

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