血管緊張素Ⅱ及其受體拮抗劑對血管外膜成纖維細胞亞群增殖和膠原合成的影響

劉 培 李 雪 焦 展 邵鐵梅 仵 陶 溫 昕 陳曉威 安勝軍

(河北省高校生物反應器與蛋白類藥物開發(fā)應用技術研發(fā)中心 河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術學院，河北 石家莊 050026)

血管外膜成纖維細胞的增殖、遷移及轉化在血管重構的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。血管損傷后發(fā)生的管壁結構重塑是血管重建后再狹窄、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病發(fā)病的共同病理基礎〔1〕。An等〔2〕曾報道血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)能夠刺激血管外膜成纖維細胞中內(nèi)皮素-1的合成和釋放，并促進膠原生成，從而導致膠原沉積。前期研究表明〔3,4〕成纖維細胞可分為紡錘形細胞(SC)和圓形細胞(RC)兩個亞群，并發(fā)現(xiàn)兩細胞亞群在細胞增殖、遷移和內(nèi)皮素-1的合成方面存在顯著性的差異。本實驗旨在比較AngⅡ及其受體拮抗劑氯沙坦(Los)和PD123319的作用下，血管外膜成纖維細胞的兩種亞群在細胞增殖和膠原合成方面的異同，探索兩種細胞亞群在血管病理生理過程中的不同作用。

1 材料與方法

1.1實驗用動物與主要試劑 SPF級SD大鼠，雄性，6～8周齡，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀) 2008-1-003。胎牛血清(FBS)購自Lonza BioWhittaker公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶購自Gibco公司；TRIZOL購自Invitrogen公司；牛血清白蛋白(BSA)、Ang Ⅱ和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液購自Sigma公司；兔抗鼠Ⅰ型膠原單克隆抗體、兔抗鼠β-actin單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP 購自Epitomics公司；引物購自上海生工生物技術有限公司；ECL顯色液購自博彩公司；dNTP、TaqDNA聚合酶購自Promega公司；所用引物由上海生工生物技術有限公司根據(jù)設計合成，見表1。

表1 各基因引物序列長度及退火溫度

1.2方法

1.2.1血管外膜成纖維細胞亞群培養(yǎng)與鑒定〔3〕SD大鼠斷頭處死，無菌條件下取胸主動脈，清洗后于手術鏡下縱向剖開血管腔，刮去血管內(nèi)膜和中膜，剩下薄層的血管外膜，剪成約1 mm3小塊，將組織塊均勻鋪于培養(yǎng)皿上，置37 ℃、50 ml/L二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日補加適量待培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細胞生長達80%融合狀態(tài)時胰酶消化，采用克隆環(huán)法〔5〕進行單克隆細胞培養(yǎng)，獲得RC亞群和SC亞群，實驗用細胞為第3～5代成纖維細胞亞群。

1.2.2成纖維細胞純度鑒定 為了確認成纖維細胞亞群無內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和白細胞的污染，采用免疫熒光染色和逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)兩種方法鑒定〔2〕。

1.2.2.1免疫熒光染色鑒定細胞純度 以結蛋白為平滑肌細胞標記、第Ⅷ因子(vWF)為內(nèi)皮細胞標記、波形蛋白(vim)為非特異性細胞標記，以成纖維細胞為細胞模型，進行免疫熒光染色。DAPI染細胞核，置熒光顯微鏡下觀察結果。

1.2.2.2RT-PCR純度鑒定 以β-actin為內(nèi)參，vWF為內(nèi)皮細胞標記物，肌球蛋白重鏈(MHC)和Des為平滑肌細胞標記物，CD8為白細胞標記物，設計并合成相關引物，引物序列及退火溫度如表1所示。分別提取大鼠血管外膜組織和成纖維細胞亞群RNA，經(jīng)反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行梯度PCR，循環(huán)體系為1.25 UTaq聚合酶，20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，50 mmol/L KCl，0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2和20 nmol/L上下游引物。循環(huán)程序如下:95 ℃初始化5 min，95℃變性1 min，48～56℃梯度退火1 min 30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后溴乙啶染色，凝膠成像系統(tǒng)捕獲圖像。

1.2.3細胞亞群測定 將長至80%融合的兩細胞亞群用胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，生理鹽水漂洗1次，離心并棄上清后，加入0.5 ml生理鹽水重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1.2.4MTT法檢測細胞增殖活性 以1.0×107/L接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl，次日換無血清DMEM培養(yǎng)過夜，使其生長同步化。實驗分為6組，con為空白對照組、Los為氯沙坦組、PD為PD123319組、Ang Ⅱ為AngⅡ(1.0×10-7mol/L)組、Ang Ⅱ+Los為(Ang Ⅱ+Los)組、Ang Ⅱ+PD為(Ang Ⅱ+PD123319)組。首先用100 μmol/L的Los或PD123319預處理30 min，之后加或不加Ang Ⅱ，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后檢測吸光度值(A值)。細胞增殖率(%)=(實驗組A值-對照組A值)/對照組A值×100%。

1.2.5免疫印跡〔6，7〕檢測Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)的表達 實驗分組同1.2.4，培養(yǎng)24 h后提取蛋白。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉蛋白于PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉，TBST洗滌，分別經(jīng)CollagenⅠ的一抗、二抗孵育后，ECL試劑顯像。再利用清除緩沖液清除PVDF膜上已結合的一抗和二抗，重新經(jīng)β-actin一抗、二抗孵育后，再次顯像，作為內(nèi)部參照。X-膠片曝光顯影，掃描。

1.3統(tǒng)計學處理 使用GraphPad Prism5.0 軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1成纖維細胞亞群形態(tài)學觀察及純度分析 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞亞群從形態(tài)上可分為兩個亞群：RC亞群和SC亞群〔3〕。RC亞群和SC亞群均無白細胞標記物CD8和內(nèi)皮細胞標記物vWF的表達，平滑肌細胞標記物Des和MHC亦未見表達；相同實驗條件下，血管組織中各標記物均有表達，其中β-actin為內(nèi)參，見圖1，圖2。

2.2細胞亞群分析 SC有2個峰，而RC只有1個峰，也就是說，SC有2個直徑，RC只有1個直徑，這與從倒置顯微鏡下觀察的結果一致，即從形態(tài)學上將成纖維細胞分為RC和SC。

2.3細胞亞群增殖活性分析 與自身對照相比，Ang Ⅱ可促進兩細胞亞群的增殖：對SC亞群的增殖率達14.9%，而對RC亞群的增殖率高達27.3%(P<0.01)。單獨應用Los或PD123319對兩細胞亞群的增殖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。當Ang Ⅱ分別與Los或PD123319聯(lián)合應用時，Ang Ⅱ對兩細胞亞群的增殖作用表現(xiàn)出顯著性差異。SC亞群：Ang Ⅱ的促增殖作用受到抑制。RC亞群：氯沙坦顯著性抑制了Ang Ⅱ的促增殖作用，抑制率高達-24.2%(P<0.01)，PD123319對Ang Ⅱ的促增殖作用沒有顯著性影響，與單獨應用Ang Ⅱ的增殖率無顯著性差異。見表2。

2.4Western印跡法檢測細胞亞群Collagen Ⅰ的表達 以兩細胞亞群為模型，經(jīng)氯沙坦或PD123319單獨用藥后與空白組相比，Collagen Ⅰ的合成差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。經(jīng)Ang Ⅱ作用后，Collagen Ⅰ的合成均有不同程度增加，其中RC亞群Collagen 的合成增加有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與Ang Ⅱ組相比，氯沙坦預處理后，顯著抑制了Ang Ⅱ誘導的RC亞群Collagen Ⅰ的表達(P<0.01)，而對SC亞群Collagen Ⅰ的表達無明顯影響；PD123319預處理后，對SC和RC Collagen Ⅰ的表達均無明顯影響。見表3。

圖中DAPI染細胞核(藍色)，A、B、C分別用平滑肌細胞標記物結蛋白、內(nèi)皮細胞標記物第vWF和成纖維細胞標記物波形蛋白染色

1～13：Marker,vWF,組織，vWF,SC,vWF,RC,CD8,組織，CD8，SC,CD8，RC,WHC，組織，MHC,SC,MHC,RC,Des，組織，Des，SC,Des,RC

組別紡錘形細胞OD值圓形細胞OD值空白對照組0.382 0±0.0290.398 9±0.025氯沙坦組0.390 8±0.0280.409 5±0.030PD123319組0.367 6±0.0300.382 0±0.016AngⅡ組0.439 1±0.0050.490 8±0.0081)AngⅡ+Los組0.407 0±0.0510.333 4±0.0203)AngⅡ+PD組0.396 8±0.0170.508 2±0.0242)

表3 Western印跡法檢測Collagen Ⅰ的表達±s)

3 討 論

外膜成纖維細胞異常增殖及膠原合成是不良血管重塑的重要病理變化，也是高血壓維持、惡化的基礎〔8,9〕，是在各種外界刺激的作用下，細胞外信號經(jīng)過細胞內(nèi)信號傳遞細胞到達核內(nèi)，誘導一系列與成纖維細胞增殖相關的基因表達，啟動細胞周期，從而推動成纖維細胞分裂、增殖以及膠原沉積。因此，抑制成纖維細胞的增殖和膠原沉積是抗不良血管重塑的基本策略。Ang Ⅱ可引起血管收縮、血壓增高、交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮、醛固酮分泌促進水鈉潴留，還致細胞生長增殖，細胞外基質成分合成增加，促進其他生長因子和生物活性物質釋放，在心肌、血管組織的病理性重構、順應性下降、功能失代償?shù)倪^程中起著重要作用〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度Ang Ⅱ(10-7～10-9)mol/L對細胞亞群的增殖能力有不同程度的促進作用，其中Ang Ⅱ 10-7mol/L對SC亞群的增殖活性無顯著性影響(增殖率6.8%，P>0.05)，而對RC亞群的增殖作用有顯著促進作用(增殖率30.5%，P<0.01)。本實驗結果顯示氯沙坦作為Ang Ⅱ1型受體拮抗劑能夠阻斷Ang Ⅱ對RC亞群的增殖促進作用，而Ang Ⅱ Ⅱ型受體拮抗劑PD123319 的這種作用不明顯，說明對于RC亞群，Ang Ⅱ主要通過Ang Ⅱ1型受體來介導此作用，而Ang Ⅱ對SC亞群的增殖能力無顯著影響。

本研究結果表明在RC亞群中氯沙坦能顯著性地阻斷Ang Ⅱ刺激下的 Ⅰ型膠原的合成，而對SC亞群Ⅰ型膠原的表達無顯著影響；PD123319對兩細胞亞群I型膠原表達的差異均無統(tǒng)計學意義。

綜上所述， SD大鼠血管外膜成纖維細胞亞群，可分為SC亞群和RC亞群，并從形態(tài)學說明了成纖維細胞亞群的異質性。結合以往研究，提示兩細胞亞群在血管的重建和修復過程中發(fā)揮不同作用，SC亞群可能在維持血管穩(wěn)定及血管正常結構和功能中發(fā)揮重大作用；而RC亞群可能在血管新生內(nèi)膜形成、不良血管重塑和血管再狹窄等病變中扮演了重要角色。本實驗只在離體細胞水平進行了初步研究，在整體病理生理過程中的作用特點，還有待進一步證實。

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