重組人血管內(nèi)皮抑素和長春瑞濱對人肺腺癌裸鼠移植瘤放射增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究

程小峰 張蓓蓓 高春玲 葉性景 張雅雅 丁 園 章志勇

非小細(xì)胞肺癌在世界范圍內(nèi)都是常見病。肺癌患者的預(yù)后都很差，5年存活率只有13%。要提高非小細(xì)胞肺癌患者的生存率，我們需早期診斷，早期治療。

重組人血管內(nèi)皮抑素是分子量為20 kD的纖維素18因子的羧基端短肽。有研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，重組人血管內(nèi)皮抑素能夠抑制移植瘤(非小細(xì)胞肺癌，黑色素瘤，胰腺癌等)的生長，并且能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。在臨床試驗(yàn)中[3]非小細(xì)胞肺癌患者接受重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合順鉑治療，CBR 為 82.4%。有研究證實(shí)重組人血管內(nèi)皮抑素有照射增敏作用[4]。

長春瑞濱是1種半合成的長春新堿類化療藥[5]，在有絲分裂時(shí)阻止微管的聚集。Sarkar等[6]研究顯示長春瑞濱對頭頸腫瘤有放射增敏作用。

重組人血管內(nèi)皮抑素和長春瑞濱均具有放射增敏作用，本研究試圖探討兩者聯(lián)合對于照射的增敏是否存在協(xié)同作用，并探討重組人血管內(nèi)皮抑素和放射的最佳結(jié)合時(shí)機(jī)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和細(xì)胞株

雄性裸鼠，4-5周齡，體重20 g左右，購自廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)藥品和試劑：DMEM培養(yǎng)基，(Gibco公司)；長春瑞濱，(法國皮爾法伯制藥公司)；重組人血管內(nèi)皮抑素，(山東先聲麥得津生物公司)。細(xì)胞株為973細(xì)胞株，廈門大學(xué)抗癌研究中心惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人肺腺癌裸鼠模型的建立 將呈指數(shù)增長的973細(xì)胞消化后制成濃度為3×106/mL個(gè)細(xì)胞的懸液。每只鼠右下肢大腿皮下注入0.1 mL細(xì)胞懸液，隔日觀察，待移植瘤長足夠大小入組。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將48只裸鼠隨機(jī)分為6組：對照組、重組人血管內(nèi)皮抑素組、長春瑞濱組、長春瑞濱聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑素和放射組、重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合放射組、單照組。

1.2.3 放射方法 采用Varian 600直線加速器6MV-X線放射。將荷瘤裸鼠裝入一自制的有機(jī)玻璃盒內(nèi)，并將其用橡皮圈固定在一塑料板上，腫瘤暴露在正中，裸鼠其他部分采用鉛塊遮擋，腫瘤表面放置1.5 cm有機(jī)玻璃板，在直線加速器下進(jìn)行放射。腫瘤直徑長至0.5～0.8 cm時(shí)分組，第一批于給藥第1天開始放射。第二批于給藥第7天開始放射，放射劑量均為10 Gy。

1.2.4 給藥方法 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組和裸鼠體重計(jì)算給藥劑量，采用腹腔注射給藥方法，長春瑞濱2 mg/kg，放射前24 h給藥；重組人血管內(nèi)皮抑素20 mg/kg·d，用生理鹽水稀釋。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組方法和每只裸鼠體重計(jì)算給藥劑量，然后腹腔注射已經(jīng)稀釋好的藥液，對照組注射同等體積的生理鹽水。當(dāng)腫瘤直徑增長至0.5 cm時(shí)開始用藥，每天1次，連續(xù)14天。

1.2.5 評價(jià)方法 分組后觀察荷瘤鼠的一般情況，實(shí)驗(yàn)采用盲法，隔日由專人用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的最長徑( A )及其垂直徑( B )和高(C)，并按公式V=π/6·A·B·C計(jì)算腫瘤體積。

當(dāng)每只裸鼠腫瘤的體積增長至用藥時(shí)腫瘤體積的兩倍時(shí)為實(shí)驗(yàn)終止點(diǎn)。絕對腫瘤生長延緩時(shí)間(absolute growth delay，AGD)=TR-TC(TR 為單純放射組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù)，TC為對照組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù))。規(guī)格化腫瘤生長延緩時(shí)間(normalized growth delay，NGD)=TL-TG(TL為聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù)，TG為單純藥物組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù))；增敏系數(shù)(EF)=NGD/AGD，EF>1 提示有放射增敏效應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用origin軟件繪制腫瘤生長曲線，應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用mann-whitney u檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 第1天放射荷瘤鼠的一般情況

分組治療后隨時(shí)間的推移，對照組小鼠進(jìn)食、活動(dòng)未見異常，5～6只小鼠右下肢腫瘤局部皮膚潰爛；而單獨(dú)放射和聯(lián)合治療組小鼠活動(dòng)及進(jìn)食未受影響，2～3只小鼠右下肢腫瘤皮膚潰爛。

2.2 第1天放射荷瘤鼠腫瘤生長曲線

對照組、長春瑞濱組腫瘤生長情況相似；10 Gy放射組從第8天開始，腫瘤水腫期過去，生長較對照組受到不同程度抑制(P=0.003)，藥物加放射組腫瘤生長較對照組生長抑制明顯，尤以重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合10 Gy最明顯(P=0.000)，重組人血管內(nèi)皮抑素和長春瑞濱聯(lián)合放射組生長曲線位于10 Gy放射和重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合10 Gy之間，較對照組抑制明顯(P=0.001)，從給藥第12天開始，重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合放射組較單照組腫瘤有輕度生長抑制(P=0.048)，重組人血管內(nèi)皮抑素+長春瑞濱+10 Gy組與單照組腫瘤生長情況相似。根據(jù)各組小鼠腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線(圖1)。

圖1 照射第1天時(shí)各組腫瘤的生長曲線

2.3 第1天放射腫瘤生長延緩時(shí)間及增敏系數(shù)

重組人血管內(nèi)皮抑素的EF 值為1.1。重組人血管內(nèi)皮抑素和長春瑞濱聯(lián)合治療組增敏系數(shù)為0.1，即無明顯增敏作用。由此可見長春瑞濱的作用和重組人血管內(nèi)皮抑素的作用發(fā)生了拮抗，使兩藥各自的放射增敏作用消失(表1)。

組別 腫瘤倍增時(shí)間/天AGDNGDEF對照組 2.0+ 1.4---10 Gy 11.0±1.19--重組人血管內(nèi)皮抑素 10±1.58--長春瑞濱 3±1.21--重組人血管內(nèi)皮抑素+10 Gy 20.0±1.118101.1長春瑞濱+重組人血管內(nèi)皮抑素+10 Gy 12±1.11010.1

表2 第7天照射時(shí)重組人血管內(nèi)皮抑素與長春瑞濱對肺腺癌的放射增敏作用

2.4 第7天放射荷瘤鼠的一般情況

分組治療后隨時(shí)間的推移，對照組小鼠進(jìn)食、活動(dòng)未見異常，5～6只小鼠右下肢腫瘤局部皮膚潰爛；而單獨(dú)放射和聯(lián)合治療組小鼠活動(dòng)及進(jìn)食未受影響，2～3只小鼠右下肢腫瘤皮膚潰爛。

2.5 第7天放射荷瘤鼠腫瘤生長曲線

對照組、長春瑞濱組腫瘤生長情況相似；10 Gy放射組從第12天開始，腫瘤水腫期過去，生長受到不同程度地抑制(P=0.005)，從第12天起，重組人血管內(nèi)皮抑素加放射組腫瘤生長較對照組生長抑制明顯(P=0.029)，重組人血管內(nèi)皮抑素和長春瑞濱聯(lián)合放射組生長曲線位于10 Gy放射組和重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合10 Gy組之間，從第20天起，重組人血管內(nèi)皮抑素和長春瑞濱聯(lián)合放射組較對照組腫瘤生長抑制明顯(P=0.036)，重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合放射組較10 Gy放射組腫瘤有輕度生長抑制(P=0.027)，重組人血管內(nèi)皮抑素+長春瑞濱聯(lián)合10 Gy組較10 Gy放射組腫瘤生長抑制明顯(P=0.023)。根據(jù)各組小鼠腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線(圖2)。

2.6 第7天放射荷瘤鼠腫瘤生長延緩時(shí)間及增敏系數(shù)

重組人血管內(nèi)皮抑素的EF值為2。重組人血管內(nèi)皮抑素和長春瑞濱聯(lián)合放射組的增敏系數(shù)為1，即無明顯增敏作用。由此可見長春瑞濱的作用和重組人血管內(nèi)皮抑素的作用發(fā)生了拮抗，使兩藥原本的放射增敏作用消失(表2)。

圖2 照射第7天時(shí)各組腫瘤的生長曲線

3 討論

隨著新一代化療藥的出現(xiàn)，放化同步治療已成為中晚期非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療模式，與單純放射相比，放化療結(jié)合能提高腫瘤的控制率并能延長患者的生存時(shí)間，但與放射結(jié)合的最佳的化療藥物及降低放化療毒性的方案仍在研究中。

重組人血管內(nèi)皮抑素直接抑制血管生成，同時(shí)上調(diào)其他血管生成抑制劑的表達(dá)[7]。重組人血管內(nèi)皮抑素下調(diào)HIF-1a的同時(shí)，通過上調(diào)HIF-1an(HIF-1a的直接拮抗劑)來加強(qiáng)抗血管生成作用。重組人血管內(nèi)皮抑素在治療中通過與其他的信號通路相互作用產(chǎn)生抗血管生成協(xié)同作用。包括各種調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長的過程，如誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使內(nèi)皮細(xì)胞周期停滯，使內(nèi)皮細(xì)胞遷移減少等。重組人血管內(nèi)皮抑素下調(diào)的因子包括HIF-1a，NF-KB，Ets-1和STATs，這些都是抗凋亡基因的上調(diào)調(diào)節(jié)因子，STATs，NF-KB，和AP-1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期素如細(xì)胞周期素D促進(jìn)增值。重組人血管內(nèi)皮抑素下調(diào)這些信號通路分子，同時(shí)下調(diào)Id家族的轉(zhuǎn)錄因子，這與觀察到的重組人血管內(nèi)皮抑素使細(xì)胞周期停滯是一致的。同時(shí)，重組人血管內(nèi)皮抑素的抗內(nèi)皮細(xì)胞遷移效果可能源于抑制MAPK并且下調(diào)myc。

總之，重組人血管內(nèi)皮抑素作為一個(gè)血管控制程序的整合角色，最終的效果是加強(qiáng)重組人血管內(nèi)皮抑素的抗血管生成效果。所有這些研究顯示血管生成抑制可能是重組人血管內(nèi)皮抑素抑制腫瘤的主要因素[8]。

長春瑞濱是NSCLC最常用的化療藥物之一，通過與微管蛋白結(jié)合，使微管蛋白發(fā)生空間構(gòu)象改變，成為螺旋狀而無法聚合成微管，進(jìn)而抑制有絲分裂時(shí)紡錘體的形成，使細(xì)胞停滯于有絲分裂的中期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)單純放射組腫瘤生長受到不同程度的抑制，藥物加放射組腫瘤生長受到抑制，尤以重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合10 Gy最明顯。重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合放射時(shí)，當(dāng)放射時(shí)間位于重組人血管內(nèi)皮抑素用藥第1天時(shí)效果輕微，而放射位于重組人血管內(nèi)皮抑素用藥第7天時(shí)效果明顯。陳明等[11]研究發(fā)現(xiàn)，重組人血管內(nèi)皮抑素用藥第7～9天，腫瘤血管正?；潭茸詈茫穗A段稱為血管正?；翱谄?。我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果驗(yàn)證了這一結(jié)論。

重組人血管內(nèi)皮抑素和長春瑞濱聯(lián)合放射組的增敏系數(shù)為1和0.1，即無明顯的增敏作用。由此可見長春瑞濱的作用和重組人血管內(nèi)皮抑素的作用發(fā)生了拮抗，使兩藥原本的放射增敏作用消失。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示長春瑞濱和重組人血管內(nèi)皮抑素的放射增敏作用有拮抗作用。

細(xì)胞內(nèi)微管蛋白分為α、β 2個(gè)亞型，是細(xì)胞骨架的重要組成部分。人類細(xì)胞中存在著6種β微管蛋白同型體，其中3型β微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ)與作用于微管的化療藥物敏感性有最密切的關(guān)系。Pascal Sève等研究發(fā)現(xiàn)tubulin Ⅲ過表達(dá)與長春瑞濱治療反應(yīng)關(guān)系密切。Mozzetti’s和Pascal Sève研究認(rèn)為β-tubulin Ⅲ可能是抗微管藥物的一個(gè)耐藥機(jī)制之一[12]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)RLIP76是長春瑞濱的轉(zhuǎn)運(yùn)劑，通過把長春瑞濱泵出細(xì)胞，減少長春瑞濱對腫瘤細(xì)胞的毒性。這是長春瑞濱的耐藥機(jī)制之一[13].這些長春瑞濱的耐藥機(jī)制可能是兩藥的拮抗機(jī)制之一。

重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合長春瑞濱和順鉑方案已在臨床廣為應(yīng)用，臨床研究顯示此方案在肺癌治療中效果良好，此方案的機(jī)制闡述較少。

長春瑞濱對人非小細(xì)胞肺癌的放射增敏作用，其機(jī)制主要是使腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期集中在G2/M期。放射的機(jī)制是通過DNA損傷和使細(xì)胞周期停滯于G2期，和長春瑞濱的作用機(jī)制產(chǎn)生協(xié)同作用。長春瑞濱的分子機(jī)制類似泰素和長春堿類，都是通過結(jié)合微管蛋白，干擾微管的運(yùn)動(dòng)和聚合[6]。

順鉑除了直接的細(xì)胞毒性還有潛在增強(qiáng)放射誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷作用。順鉑作為放射增敏劑增加腫瘤細(xì)胞核DNA的損傷[14-16]。

重組人血管內(nèi)皮抑素的放射增敏機(jī)制尚未明確，有研究[17]發(fā)現(xiàn)重組人血管內(nèi)皮抑素能夠提高腫瘤內(nèi)部的氧含量，對放射增敏主要通過減少腫瘤微血管密度，減少不成熟的血管，增加主要血管的血流。

重組人血管內(nèi)皮抑素的作用靶點(diǎn)主要針對新生血管。而長春瑞濱的作用靶點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白。順鉑影響的是腫瘤細(xì)胞的DNA。三者的放射增敏機(jī)制并未見交叉，我們的研究長春瑞濱和重組人血管內(nèi)皮抑素放射增敏作用產(chǎn)生拮抗效應(yīng)，機(jī)制有待探討若增加順鉑是否會(huì)改變這種拮抗效應(yīng)有待于進(jìn)一步研究。

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