RKIP的克隆、表達(dá)及其影響腫瘤細(xì)胞遷移性質(zhì)的初步研究

皮亞洲，華子春

(南京大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210093)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表達(dá)載體pET28a(+)購自Novagen公司，克隆菌株Top10和表達(dá)菌株BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室提供。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、PCR試劑、Pyrobest DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司。柱離心式膠回收小提試劑盒和柱離心式質(zhì)粒小提試劑盒購自上海申能博彩公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.4 RKIP在細(xì)胞外對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響 首先將A549細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，生長(zhǎng)24 h，單層細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右。用新的200 μl槍頭在各組細(xì)胞中劃痕，記錄此時(shí)(0 h)各組細(xì)胞劃痕寬度(單位為像素)。具體測(cè)量方法為：在顯微鏡下，每個(gè)孔取3個(gè)不同的視野，測(cè)量各個(gè)視野下劃痕的垂直距離，細(xì)胞劃痕間距取3個(gè)垂直距離的平均值。以牛血清白蛋白(BSA)作為對(duì)照，設(shè)定不同的蛋白濃度梯度：不加藥組作為空白對(duì)照，其余各組蛋白終濃度為50、100、200、400 ng·ml-1。將各組蛋白濃度依次調(diào)節(jié)至設(shè)定濃度，細(xì)胞生長(zhǎng)48 h后再次記錄各組細(xì)胞劃痕間距(單位為像素)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增RKIP基因

按照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增得到RKIP基因片段，PCR所得產(chǎn)物使用DNA瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，結(jié)果表明基因大小正確(圖1),為562 bp，之后從凝膠中切割并回收。

M.DNA標(biāo)記DL2000； 1.RKIP基因片段

圖1RKIP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig1ThePCRproductofgeneencodingRKIP

2.2 重組質(zhì)粒pET28 RKIP的構(gòu)建與鑒定

RKIP基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增和雙酶切，然后與雙酶切的pET28a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)預(yù)先制備的Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落經(jīng)雙酶切鑒定(圖2)，最后通過DNA測(cè)序分析顯示RKIP片段插入載體中，并且其閱讀框序列保持不變。

2.3 Hi RKIP的表達(dá)與純化

2.4 不同濃度的RKIP在細(xì)胞外對(duì)細(xì)胞遷移的影響

由于在0 h的劃痕距離不能保證一致，采用間距變化的百分比可以抵消這一不同因素的影響，圖4為不同蛋白濃度下各組細(xì)胞劃痕間距變化百分比情況。

3 討 論

M.蛋白質(zhì)標(biāo)記； 1.細(xì)菌超聲后沉淀； 2.細(xì)胞超聲后上清； 3.穿過液； 4.250 mmol·L-1咪唑洗脫液收集液； 5.去除咪唑后的收集液

t檢驗(yàn)，n=3； aP<0.05； bP<0.01

圖4不同BSA和RKIP濃度下劃痕間距變化

Fig4ThewoundhealingchangesunderdifferentconcentrationofRKIPandBSAprotein