玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠免疫調(diào)節(jié)的影響

張露蓉，姚霏，江國榮

(蘇州市中醫(yī)醫(yī)院 中醫(yī)藥研究所，江蘇 蘇州 215009)

大量的免疫學(xué)研究證明，腫瘤一旦在機(jī)體內(nèi)發(fā)生發(fā)展，機(jī)體的免疫系統(tǒng)可能通過多種途徑參與抗腫瘤的免疫效應(yīng)，以消除腫瘤細(xì)胞或控制腫瘤的生長。中醫(yī)藥抗腫瘤的免疫機(jī)制多與其提高機(jī)體免疫有關(guān)[1-4]，如增加巨噬細(xì)胞吞噬能力、自然殺傷細(xì)胞的殺傷能力，促進(jìn)淋巴因子、白細(xì)胞介素-2(IL-2)的產(chǎn)生，增加T細(xì)胞表面IL-受體(IL-2R)的表達(dá)、促進(jìn)T細(xì)胞增殖，糾正T細(xì)胞亞群紊亂等。

玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)組成，具有扶正固表、標(biāo)本兼治的治療作用，是增強(qiáng)衛(wèi)氣的首選方劑?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為衛(wèi)氣與免疫功能緊密相關(guān)，藥理學(xué)研究也證明玉屏風(fēng)散具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用[5-6]，但其對腫瘤狀態(tài)下的機(jī)體免疫調(diào)節(jié)報(bào)道很少[7-8]。作者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，玉屏風(fēng)散可抑制Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠腫瘤生長，該作用是增強(qiáng)機(jī)體免疫和微弱的直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的綜合效應(yīng)(另文發(fā)表)。本研究在保證玉屏風(fēng)散一定抑瘤效應(yīng)的前提下，觀察與分析玉屏風(fēng)散對肝癌小鼠機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)作用及促進(jìn)抗肝癌免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，為玉屏風(fēng)散在臨床抗肝癌中的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)近交C57BL/6純系小鼠，雄性，體重18～22 g，購自蘇州愛爾麥特科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2009-001。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 玉屏風(fēng)散，由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)組成。黃芪、白術(shù)購自蘇州市春暉堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)均為100601；防風(fēng)購自蘇州市天靈中藥飲片有限公司，批號(hào)101115-1。按黃芪∶白術(shù)∶防風(fēng)為3∶1∶1的比例，加入8倍量低溫水，浸泡0.5 h，回流提取2次，每次1 h。合并兩次濾液,濃縮，得濃度為1.0 g生藥·ml-1濃縮液，-4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑 DMEM培養(yǎng)液(GIBCO公司，批號(hào)1320158)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)100511)，氟化鈉(上海化學(xué)試劑供應(yīng)站，批號(hào)890425)，F(xiàn)ITC的小鼠CD4抗體(eBioscience，批號(hào)E00078-133)，PerCP-Cy5.5的小鼠CD8a抗體(eBios-cience，批號(hào)E08300-1630)，F(xiàn)ITC的小鼠CD11b抗體(eBioscience，批號(hào)E033742)，APC的小鼠CD19抗體(eBioscience，批號(hào)E030718)，PE的小鼠CD80抗體(eBioscience，批號(hào)E01355-1630)，順鉑(凍干型，山東齊魯制藥有限公司，批號(hào)0070171DB)，香菇多糖注射液(金陵藥業(yè)股份有限公司福州梅峰制藥廠，批號(hào)101001-1)，碳酸氫鉀、氯化銨、EDTA-Na2等試劑(均為國產(chǎn)分析純)。

1.1.4 主要儀器 賀利二氧化碳培養(yǎng)箱(美國科峻儀器公司)，Leica DMIL倒置顯微鏡(德國萊卡儀器有限公司)，Z 320 K低溫高速離心機(jī)(德國HERMLE公司)，電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6由蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院惠贈(zèng)，采用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM(pH 7.0)完全培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 Hepa-6肝癌荷瘤小鼠模型的建立和分組處理 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后用于種瘤。取對數(shù)生長期的Hepa1-6細(xì)胞，消化后用PBS稀釋成1× 107ml-1的細(xì)胞懸液，接種于小鼠右腋皮下，每只接種體積為0.2 ml。當(dāng)捫及接種小鼠皮下結(jié)節(jié)直徑約達(dá)5 mm時(shí)進(jìn)行隨機(jī)分組，分為模型對照組(生理鹽水組)， 陽性藥順鉑組(5 mg·kg-1)和香菇多糖組(1.25 mg·kg-1)，玉屏風(fēng)散20、25、30 g生藥·kg-1組，每組5只小鼠。分組當(dāng)天開始給藥，順鉑組每3 d腹腔注射1次；其余組每日灌胃2次(間隔12 h進(jìn)行)。連續(xù)給藥兩周，末次給藥12 h后稱重，放血后斷髓處死小鼠。解剖剝離瘤體、脾臟和胸腺，稱重并記錄。分別計(jì)算抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。計(jì)算公式：抑瘤率=[1-(藥物組平均瘤質(zhì)量/模型對照組平均瘤質(zhì)量)]×100%；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)×10；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)×10。

1.2.3 脾細(xì)胞懸液的制備 取稱重后的小鼠脾臟，剪碎，在毛玻片上磨細(xì)，過200目尼龍網(wǎng)，收集濾液，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入10～15 ml紅細(xì)胞裂解液，混懸脾細(xì)胞，靜置10～20 min后1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，再用PBS洗1遍細(xì)胞，最后加1 ml流式細(xì)胞緩沖液重新懸浮細(xì)胞。以上操作均在冰上進(jìn)行。

1.2.4 免疫熒光標(biāo)記法測定細(xì)胞亞群 于96孔板中加入50 μl 用流式細(xì)胞緩沖液懸浮好的脾細(xì)胞(每孔1×105～1×106個(gè)細(xì)胞)，加入50 μl已經(jīng)用流式細(xì)胞緩沖液稀釋好的各抗體(CD4、CD8、CD11b、CD19和CD80)，混勻后4 ℃避光孵育30 min。每孔加入200 μl 流式細(xì)胞緩沖液洗滌細(xì)胞3遍，1 200 r·min-1離心5 min，棄200 μl上清。再加200 μl 流式細(xì)胞緩沖液，轉(zhuǎn)移到流式管中，流式細(xì)胞儀檢測。每個(gè)樣本收集10 000個(gè)細(xì)胞用于數(shù)據(jù)分析，采用FLOWJO軟件處理樣品數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制

與模型對照組比較，玉屏風(fēng)散組的腫瘤質(zhì)量呈現(xiàn)下降趨勢，且具有一定的劑量依賴性(玉屏風(fēng)散20、25和30 g生藥·kg-1組的抑瘤率依次為18.86%、28.81%和37.44%)；其抑瘤效應(yīng)與香菇多糖組(35.19%)相近，明顯弱于順鉑組(54.19%)。見圖1，提示玉屏風(fēng)散可抑制Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長。

1.模型對照組； 2.順鉑組； 3.香菇多糖組； 4.玉屏風(fēng)散20 g生藥·kg-1組； 5.玉屏風(fēng)散25 g生藥·kg-1組； 6.玉屏風(fēng)散30 g生藥·kg-1組； a 與模型對照組比較，P<0.05

圖1玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用

Fig1YPFsuppressedthetumorgrowthintheHepa1-6hepatoma-bearingmice

2.2 玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠胸腺和脾臟的影響

與模型對照組相比，玉屏風(fēng)散組胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)均無顯著變化；脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，玉屏風(fēng)散30 g生藥·kg-1組較模型對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表明玉屏風(fēng)散在抑制腫瘤時(shí)對脾臟有促進(jìn)作用，但對胸腺無影響。

2.3 玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌小鼠脾臟中B細(xì)胞活化的影響

以CD19+代表B細(xì)胞，CD19+CD80+代表活化的B細(xì)胞分析：與模型對照組相比，玉屏風(fēng)散組CD19+B細(xì)胞比例無變化，但其數(shù)量有所增加；其中玉屏風(fēng)散25、30 g生藥·kg-1組CD19+B細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)。見圖3。進(jìn)一步研究顯示，玉屏風(fēng)散25、30 g生藥·kg-1組CD19+CD80+細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01)。結(jié)果顯示玉屏風(fēng)散使用后可促進(jìn)肝癌小鼠脾臟中B細(xì)胞的活化，提示玉屏風(fēng)散能夠促進(jìn)腫瘤狀態(tài)下體液免疫細(xì)胞的活化。

A B

A.玉屏風(fēng)散對胸腺和脾臟質(zhì)量的影響； B.玉屏風(fēng)散對胸腺和脾臟指數(shù)的影響； 1.模型對照組； 2.玉屏風(fēng)散20 g生藥·kg-1組； 3.玉屏風(fēng)散25 g生藥·kg-1組； 4.玉屏風(fēng)散30 g生藥·kg-1組； a 與模型對照組比較，P<0.05

圖2玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠胸腺和脾臟的影響

Fig2EffectofYPFontheweightandcoefficientofthymusandspleenintheHepa1-6hepatoma-bearingmice

A.Effect of YPF on the weight of thymus and spleen； B.Effect of YPF on the coefficient of thymus and spleen

A B C

A.玉屏風(fēng)散對CD19+B細(xì)胞比例的影響； B.玉屏風(fēng)散對CD19+B細(xì)胞數(shù)量的影響； C.玉屏風(fēng)散對CD19+CD80+B細(xì)胞比例的影響；與模型對照組比較：aP<0.05，bP<0.01

圖3玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠脾臟B細(xì)胞的影響

Fig3EffectofYPFonthespleenBcellsintheHepa1-6hepatoma-bearingmice

A.Effect of YPF on the CD19+B cells proportion；B. Effect of YPF on the CD19+B cells number；C.Effect of YPF on the CD19+CD80+B cells proportion

2.4 玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞的影響

以CD11b+代表活化的巨噬細(xì)胞，與模型對照組比較，玉屏風(fēng)散組脾巨噬細(xì)胞比例和數(shù)量均增加，其中玉屏風(fēng)散20、30 g生藥·kg-1組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，圖4)。結(jié)果顯示玉屏風(fēng)散使用后可增加肝癌小鼠的脾巨噬細(xì)胞比例和數(shù)量，且隨著劑量增大有所增加，提示玉屏風(fēng)散能促進(jìn)腫瘤狀態(tài)下非特異性免疫細(xì)胞的活化。

2.5 玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌小鼠T細(xì)胞的影響

2.5.1 玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌小鼠脾臟中T細(xì)胞的影響 與模型對照組比較，玉屏風(fēng)散組脾臟中CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例均無變化(P>0.05)；而CD4+T和CD8+T細(xì)胞數(shù)量均為增加，其中玉屏風(fēng)散25、30 g生藥·kg-1組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。結(jié)果表明玉屏風(fēng)散使用后，可增加肝癌小鼠脾臟中的T細(xì)胞數(shù)量。

2.5.2 玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌小鼠腫瘤中T細(xì)胞的影響 與模型對照組比較，玉屏風(fēng)散組腫瘤組織中

A B

A.玉屏風(fēng)散對巨噬細(xì)胞比例的影響； B.玉屏風(fēng)散對巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響； 與模型對照組比較：aP<0.05，bP<0.01

圖4玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞的影響

Fig4EffectofYPFonthespleenmacrophagecellsintheHepa1-6hepatoma-bearingmice

A.Effect of YPF on the macrophage cells proportion； B.Effect of YPF on the macrophage cells number

A B

A.玉屏風(fēng)散對CD4+和CD8+T細(xì)胞比例的影響； B.玉屏風(fēng)散對CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量的影響； 1.模型對照組； 2.玉屏風(fēng)散20 g生藥·kg-1組； 3.玉屏風(fēng)散25 g生藥·kg-1組； 4.玉屏風(fēng)散30 g生藥·kg-1組； a與模型對照組比較，P<0.05

圖5玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠脾臟中CD4+T和CD8+T細(xì)胞的影響

Fig5EffectofYPFonthespleenCD4+TandCD8+TcellsintheHepa1-6hepatoma-bearingmice

A.Effect of YPF on the CD4+and CD8+T cells proportion； B.Effect of YPF on the CD4+and CD8+T cells number

CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例均顯著增加(P<0.05，P<0.01，圖6)，表明使用玉屏風(fēng)散可使腫瘤組織中T細(xì)胞比例增加，提示玉屏風(fēng)散可能促進(jìn)大量T細(xì)胞募集至腫瘤組織。

3 討 論

在整體抑瘤實(shí)驗(yàn)中，玉屏風(fēng)散20、25、30 g生藥·kg-13個(gè)劑量組均表現(xiàn)出一定的抑瘤作用，抑瘤率依次為18.86%、28.81%和37.44%，低于化療藥順鉑組的54.19%，與免疫增強(qiáng)劑香菇多糖組(35.19%)相近。而前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，玉屏風(fēng)散25 g生藥·kg-1對Hepa1-6荷瘤裸鼠的腫瘤無抑制作用，30 g生藥·kg-1則呈現(xiàn)微弱的抑制作用(抑制率為9.55%)。裸鼠由于無胸腺，為免疫缺陷的小鼠。腫瘤移植于裸鼠，能保持其生物學(xué)特性，用于研究藥物直接殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)。而C57小鼠為免疫健全小鼠，其體現(xiàn)的藥物抗腫瘤效應(yīng)為直接殺傷和免疫增強(qiáng)的綜合作用。因此，玉屏風(fēng)散對裸鼠和C57小鼠抗肝癌效應(yīng)的差異，可推測玉屏風(fēng)散的抗肝癌作用主要是通過增強(qiáng)機(jī)體免疫功能而發(fā)揮的抑瘤效應(yīng)。因此，本研究針對玉屏風(fēng)散調(diào)節(jié)肝癌小鼠機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)展開研究。

一些免疫抑制劑可使胸腺、脾臟等免疫器官萎縮；而免疫增強(qiáng)劑可使它們增重。因此，免疫器官質(zhì)量的變化可作為觀察藥物對免疫影響的指標(biāo)之一[9]。本研究選用中樞免疫器官胸腺和外周免疫器官脾臟，觀察肝癌小鼠給予玉屏風(fēng)散后對它們質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響。結(jié)果顯示玉屏風(fēng)散對胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)均無影響。胸腺是T細(xì)胞分化發(fā)育的場所，發(fā)育成熟的T細(xì)胞再經(jīng)血液遷移到脾、淋巴結(jié)等。本研究同時(shí)觀察到玉屏風(fēng)散可增加肝癌小鼠脾臟中的T細(xì)胞數(shù)量和腫瘤組織中的T細(xì)胞比例，推測玉屏風(fēng)散在促進(jìn)胸腺T細(xì)胞成熟的同時(shí)，可促進(jìn)成熟T細(xì)胞向脾臟、腫瘤等遷移，表現(xiàn)出對肝癌小鼠胸腺無影響的現(xiàn)象。本研究還觀察到玉屏風(fēng)散可以增高脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)，但脾臟質(zhì)量和指數(shù)還不能完全反映免疫系統(tǒng)的活化程度，因此后續(xù)的流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫細(xì)胞亞群的活化更能夠反映免疫系統(tǒng)的活化程度。

1.模型對照組； 2.玉屏風(fēng)散20 g生藥·kg-1組； 3.玉屏風(fēng)散25 g生藥·kg-1組； 4.玉屏風(fēng)散30 g生藥·kg-1組； 與模型對照組比較：aP<0.05，bP<0.01

圖6玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠腫瘤中CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例的影響

Fig6EffectofYPFontheproportionofCD4+TandCD8+TcellsintheneoplastictissuesoftheHepa1-6hepatoma-bearingmice

CD19是B細(xì)胞表面的糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，在骨髓B祖細(xì)胞即開始表達(dá)，持續(xù)整個(gè)B細(xì)胞成熟期，是最早發(fā)現(xiàn)的B細(xì)胞系表面標(biāo)志；而CD80在靜息B細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)，在活化B細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)。CD11b是CD11c-β2整合素黏附分子，活化的巨噬細(xì)胞表面表達(dá)CD11b。因此，本研究選用CD19+CD80+和CD11b+分別作為B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化評(píng)價(jià)指標(biāo)。研究結(jié)果顯示：使用玉屏風(fēng)散，可顯著增加脾臟中CD19+細(xì)胞數(shù)量和CD19+CD80+細(xì)胞比例，以及活化的巨噬細(xì)胞比例和數(shù)量(P<0.05，P<0.01)，提示玉屏風(fēng)散具有促進(jìn)腫瘤狀態(tài)下B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化從而抑制腫瘤生長的效應(yīng)。

目前認(rèn)為機(jī)體抗腫瘤的免疫機(jī)制主要是細(xì)胞免疫，體液免疫通常僅在某些情況下起協(xié)同作用；而且發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)的免疫細(xì)胞主要包括T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答在對抗原性較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答中起很重要的作用。本研究結(jié)果顯示，使用玉屏風(fēng)散可增加肝癌小鼠脾臟中CD4+T和CD8+T細(xì)胞數(shù)量以及腫瘤組織中的比例(P<0.05，P<0.01)。表明玉屏風(fēng)散在促進(jìn)脾臟T細(xì)胞數(shù)量增多的同時(shí)，有助于T細(xì)胞募集至腫瘤組織等免疫效應(yīng)，而發(fā)揮其抗腫瘤的作用。

綜上研究結(jié)果提示，玉屏風(fēng)散的干預(yù)可促進(jìn)肝癌荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫反應(yīng)，提高其體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，從而發(fā)揮其抑制腫瘤生長的效應(yīng)。玉屏風(fēng)散通過以提高特異性細(xì)胞免疫為主的多環(huán)節(jié)、協(xié)同免疫調(diào)控，體現(xiàn)了玉屏風(fēng)散“扶正固本，標(biāo)本兼治”的巧妙組方。本研究為玉屏風(fēng)散在臨床抗肝癌中的合理應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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