VEGF、LYVE-1在肝癌組織中的表達(dá)與意義

趙建龍 王胐胐 李世朋 席守民 李文雅 丁雪貞

(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471003)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，侵襲力強(qiáng)而易發(fā)生轉(zhuǎn)移，而且手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率較高。肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移是個復(fù)雜多步驟過程，與肝癌細(xì)胞的浸潤、新生血管形成和淋巴道轉(zhuǎn)移等有關(guān)。近些年來血管內(nèi)皮生長因子VEGF在肝癌血管生成和進(jìn)展中的作用被廣泛研究〔1〕。LYVE-1是淋巴管壁透明質(zhì)酸的主要受體，且是腫瘤組織淋巴管形成的特異標(biāo)志〔2〕。而LYVE-1在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移方面的研究甚少，故本文采用免疫組織化學(xué)法檢測VEGF、LYVE-1在肝癌組織中表達(dá)及探討兩者的相關(guān)性，為肝癌的血道轉(zhuǎn)移和淋巴道轉(zhuǎn)移的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本 收集解放軍一五零中心醫(yī)院2006年6月至2011年8月接受肝癌手術(shù)治療患者術(shù)后存檔的石蠟標(biāo)本32例，癌旁組織23例與正常肝臟存檔石蠟標(biāo)本19例，所有病例均有完整臨床資料。

1.2主要試劑 一抗兔抗人VEGF、兔抗人LYVE-1(美國BIOSS生產(chǎn))，二步法免疫組化試劑盒(SP-0023)產(chǎn)自美國ZYMED公司，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。DAB顯色試劑盒(AR-0612)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3方法 采用免疫組化并嚴(yán)格按照二步法免疫組化試劑盒操作說明書進(jìn)行染色。每例蠟塊4 μm 厚連續(xù)切片3張，其中1張進(jìn)行HE 染色，另 2張進(jìn)行免疫組化染色。一抗體工作液濃度均為 1∶150。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，微波爐抗原熱修復(fù)，加封閉血清，最后進(jìn)行DAB顯色，顯微鏡下控制，自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗。然后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 用試劑盒中的陽性片作為陽性對照，PBS取代一抗作為陰性對照。細(xì)胞質(zhì)(膜)染色呈棕黃色視為陽性；對其表達(dá)判斷的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率的得分之和進(jìn)行評估。染色強(qiáng)度：無染色為0分；弱陽性為1分；中等陽性為2分；為強(qiáng)陽性為3分。陽性細(xì)胞百分率：無陽性細(xì)胞為0分；陽性細(xì)胞數(shù)<25%為1分；陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%為2分；陽性細(xì)胞數(shù)50%～75%為3分；陽性細(xì)胞數(shù)>75%為4分。兩項(xiàng)之和：0分為(-)；1～2分為(+)；3～4分為()；5～7分為()。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。樣本率的比較采用χ2和Fisher檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

VEGF、LYVE-1染色主要存在于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜亦有部分染色，見圖1、圖2。VEGF在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和肝臟正常組織(P<0.05)，見表1。LYVE-1在肝癌組織和癌旁組織中的陽性率顯著高于正常肝組織，且癌旁組織中的陽性率最高(P<0.05)，見表2。VEGF、LYVE-1在低未分化肝癌中的陽性率明顯高于高中分化者(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期肝癌組織中VEGF與LYVE-1的表達(dá)水平分別比I～Ⅱ期高(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肝癌中的陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，見表3。蛋白在肝癌中的表達(dá)存在高度相關(guān)性(r=0.383，P=0.03)。

表1 VEGF在不同肝臟組織中的表達(dá)(n)

表2 LYVE-1在不同肝臟組織中的表達(dá)(n)

表3 肝癌中VEGF、LYVE-1陽性表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系〔n(%)〕

圖1 VEGF在不同肝臟組織中的表達(dá)(DAB，×200)

圖2 LYVE-1在不同肝臟組織中的表達(dá)(DAB，×200)

3 討 論

目前國內(nèi)外有研究顯示，惡性腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管生成，VEGF能通過旁分泌形式特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加血管通透性，以誘導(dǎo)腫瘤血管生成，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用〔3～5〕。研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中VEGF的表達(dá)水平高于癌旁肝組織，并且在肝癌組織中VEGF的表達(dá)與靜脈侵襲有關(guān)〔6〕。Park等〔7〕發(fā)現(xiàn)在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中都有VEGF的表達(dá)，而且隨著肝癌組織血管形成的逐步發(fā)展，VEGF的表達(dá)程度也逐漸增加。本文結(jié)果表明VEGF是一種增加血管通透性并促進(jìn)新血管生長的細(xì)胞因子，在肝癌組織中呈高表達(dá)并與侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后等生物學(xué)行為關(guān)系密切，與腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移灶的生長中的血管生成有關(guān)〔8，9〕。

目前大量研究表明淋巴管轉(zhuǎn)移在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，而腫瘤淋巴管浸潤的發(fā)生是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前提。LYVE-1是Banerji等〔10〕于1999年在尋找與CD44(已明確的HA受體)相關(guān)的受體時，發(fā)現(xiàn)的一種新的受體，被認(rèn)為是目前特異性最強(qiáng)的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物之一。LYVE-1絕大多數(shù)只特異性地表達(dá)在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上，均勻分布于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的基底面和胞腔面〔10〕。它還可分布于肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)〔11〕，而在血管內(nèi)皮細(xì)胞上很少表達(dá)〔12〕。本文本文結(jié)果采用配對資料的檢驗(yàn)計(jì)算推測VEGF和LYVE-1在肝癌發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移尤其是淋巴轉(zhuǎn)移過程中存在協(xié)同作用。

4 參考文獻(xiàn)

1王洪海,任 寧,張 輝,等.聯(lián)合檢測VEGF、PD-ECGF和PCNA表達(dá)預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后〔J〕.中國臨床醫(yī)學(xué)，2005；12(3):448-51.

2He Y,Karpanen T.Role of lymphagiogenic fators tumor metastasis〔J〕.Biochim Biophys Acta,2004；1654(1):3-12.

3Zondor SD，Medina PJ.Bevacizumab：an angiogenesis inhibitor-with efficacy in colorectel and other malignancies〔J〕.Ann Pharmacother,2004；38(7-8):1258-64.

4Chiang IT，Liu YC，Wang WH,etal.Sorafenib inhibits TPA-induced MMP-9 and VEGF expression via suppression of ERK/NF-κB pathway in hepatocellular carcinoma cells〔J〕.In Vivo,2012；26(4):671-81.

5Takino J，Yamagishi S，Takeuchi M.Glycer-AGEs-RAGE signaling enhances the angiogenic potential of hepatocellular carcinoma by upregulating VEGF expression〔J〕.World J Gastroenterol,2012 ；18(15):1781-8.

6文 衛(wèi),楊連粵,黃耿文，等.TSP-1和VEGF在肝癌新生血管生成中的作用〔J〕.中華肝膽外科雜志,2005；11(1):20-2.

7Park YN，Kin YB.Increased expression of vascular endothelial growth factor and angiogenesis in the early stage of multistep heptocarcinogenesis〔J〕. Arch Pathol Lab Med，2000；12(4):1061-5.

8Nomiya T,Nemoto K,Nakata E,etal.Expression of thymidine phospho-rylase and VEGF in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Oncol Rep,2006；15(6):1497-501.

9Matsumoto M,Natsugoe S,Okumura H,etal.Overexpression of vascular endothelial growth factor-C correlates with lymph node micrometastasis insubmucosal esophageal cancer〔J〕.J Gastrointest Surg,2006；10(7):1016-22.

10Banerji S,Ni J,Wang SX,etal.LYVE-1，Bnewhomologue of the CD44 glycopmtein,is a lymph-specific receptor for hyaluronan〔J〕.J Cell Biol,1999；144(4):789-801.

11Mouta C,Nas ser SM,di Tomaso E,etal.LVYE-1 is not restricted to the lymph vessels：expression in nonnal liver bloodsinu soids and do wnregulation in hum an 1iver cancer and cirrhosis〔J〕.Cancer Res,2001； 61 (22):8079-84.

12王 艷,朱 波,陳正堂,等.LYVE-1在腫瘤淋巴管生成領(lǐng)域的研究〔J〕.生命的化學(xué)2005；25(4)：314-6.