吡格列酮對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制

余 智 廖小明 唐永剛 齊 立 孫 軍 劉開祥

(杭州市淳安縣第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 311700)

吡格列酮(PGZ)是一種人工合成的胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥，臨床上廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療。目前有報(bào)道提示PGZ能通過激活PPARγ抑制炎癥等過程，從而對腦缺血再灌注損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用〔1〕。但關(guān)于PPARγ激動(dòng)劑的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，應(yīng)用PGZ進(jìn)行預(yù)處理，觀察其對大鼠術(shù)后神經(jīng)功能及腦含水量、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組 清潔級SD雄性大鼠120只，重量250～280 g。術(shù)前12 h禁食不禁水，隨機(jī)(隨機(jī)數(shù)字法)分為5組，每組各24只：①假手術(shù)組；②模型組；③PGZ組；④GW9662+PGZ組(GP組)；⑤二甲基亞砜(DMSO)組。

1.2試劑 PGZ、GW9662和10% DMSO(Sigma公司，美國)；核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB及干擾素(IFN)-γ ELISA試劑盒(R&D Systems公司，美國)；甲苯胺藍(lán)(國藥集團(tuán))、原位末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒(Promega公司)；Labo fuge 400R高速低溫離心機(jī)(Heraeus公司，德國)，多功能酶標(biāo)儀(BioTek公司，美國)，電子顯微鏡(OLYMPUS，日本)等。

1.3動(dòng)物模型制備及處置 模型組：術(shù)前45 min經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水2 ml/kg，采用改良的Zea-Longa〔2〕法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)模型：麻醉成功后，取頸部左旁正中切口，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎并游離ECA的近端，將蛙心夾夾閉CCA和ICA后在ECA游離段上剪開一個(gè)小口將制備好的尼龍線栓經(jīng)CCA分支處通過ICA入顱，線栓深度為18～19 mm。缺血90 min后抽出線栓即可造成再灌注模型。PGZ組：術(shù)前45 min經(jīng)尾靜脈注射PGZ10 mg/kg。GP組：術(shù)前45 min先經(jīng)尾靜脈注射GW9662，劑量是0.3 mg/kg〔3〕，10 min后再經(jīng)尾靜脈注射吡格列酮10 mg/kg。D組：術(shù)前45 min經(jīng)尾靜脈注射10%DMSO 2 ml/kg。假手術(shù)組：術(shù)中分離左側(cè)CCA、ICA及ECA，但不做任何缺血處理。

1.4指標(biāo)檢測

1.4.1神經(jīng)功能評分 再灌注24 h后采用雙盲法嚴(yán)格按Zea-Longa 5分法進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

1.4.2腦含水量檢測 再灌注24 h后隨機(jī)抽取各組8只大鼠，立即斷頭取腦，去除小腦及低位腦干后快速用精密天平稱取濕重，然后烘至恒重，稱取干重，將(濕重-干重)/濕重×100%作為腦含水量的指標(biāo)。

1.4.3NF-κB及IFN-γ含量水平測定 再灌注24 h后，各組再隨機(jī)抽取8只大鼠，迅速斷頭取腦。于冰上在距額葉前端3 mm和9 mm處進(jìn)行冠狀分離，取中間6 mm厚的腦組織塊，然后沿此腦塊矢狀縫兩側(cè)約2 mm處，從上至下切去兩側(cè)半球的正中結(jié)構(gòu)，將左側(cè)腦塊作為缺血腦組織。嚴(yán)格按ELISA試劑盒檢測要求進(jìn)行操作。

1.4.4HE染色 將各組其余8只大鼠麻醉，以4℃生理鹽水進(jìn)行心臟快速灌洗，予多聚甲醛灌洗充分固定，并以同樣的方法取得缺血腦組織，制成蠟塊。自前往后連續(xù)冠狀位切片，厚約5 μm。HE染色光學(xué)顯微鏡下(×400)觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并采圖。

1.4.5尼氏染色及TUNEL染色 嚴(yán)格按照試劑盒檢測步驟進(jìn)行操作。尼氏染色在光鏡(×400)下觀察健存神經(jīng)元(以尼氏小體為代表)的數(shù)量，計(jì)算尼氏小體的數(shù)目/相應(yīng)的面積并采圖。TUNEL染色在光鏡下(×400)觀察凋亡細(xì)胞(以胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒代表)，計(jì)算TUNEL陽性率即TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值并采圖。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般狀況及神經(jīng)功能 與模型組相比，經(jīng)PGZ預(yù)處理的大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠一般狀況及神經(jīng)功能(n=24)

2.2腦組織含水量 與模型組相比，PGZ組大鼠含水量明顯降低(P<0.01)。5組大鼠腦組織含水量的比較見表2。

2.3NF-κB、IFN-γ含量水平及相關(guān)性分析 與模型組比較，PGZ組大鼠NF-κB及IFN-γ含量水平均顯著降低(P<0.05)。兩組腦組織NF-κB與IFN-γ含量水平均呈顯著正相關(guān)，回歸方程模型組=-0.432+0.271x，rM=0.947(P<0.001),PGZ組=-4.168+0.748x，rP=0.961(P<0.001)。見表2。

2.4HE染色 切片經(jīng)HE染色后，光鏡下可見模型組呈明顯的缺血損傷性改變，多數(shù)細(xì)胞體積縮小，正常組織結(jié)構(gòu)消失，胞質(zhì)疏松，胞核固縮深染，部分細(xì)胞壞死。PGZ組缺血性損傷改變較模型組明顯減輕，細(xì)胞膜較完整，間質(zhì)水腫減輕，壞死區(qū)域縮小。

2.5尼氏染色及TUNEL染色 假手術(shù)組尼氏小體多且體積大，呈紫色分布于核周圍，且只有少量凋亡細(xì)胞。模型組尼氏小體數(shù)量明顯減少，且變小或變形〔(63.06±9.05)%〕，而PGZ組相應(yīng)區(qū)域尼氏體數(shù)量較多且變形較少〔(48.10±7.61)%〕,兩組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2，圖1。

表2 各組大鼠腦組織含水量、 NF-κB、IFN-γ含量、尼氏小體平均數(shù)值及凋亡細(xì)胞數(shù)

A：假手術(shù)組 B：模型組 C：PGZ組 D：DMSO組 A1：假手術(shù)組 B1模型組 C1：PGZ組 D1：DMSO組(A～D:尼氏小體染色；A1～D1：TUNEL染色)

3 討 論

近期研究表明，腦缺血再灌注時(shí)神經(jīng)細(xì)胞釋放大量炎癥信號，介導(dǎo)大量炎性細(xì)胞的聚集和炎性因子的釋放〔4〕，加重缺氧直接造成的神經(jīng)元壞死和凋亡，從而放大對缺血損傷區(qū)域細(xì)胞甚至是機(jī)體的損傷。本研究也已證實(shí)，減輕炎癥反應(yīng)可抑制腦缺血再灌注損傷所致的細(xì)胞凋亡〔5〕。炎癥反應(yīng)的要素包括信號傳導(dǎo)分子、炎癥細(xì)胞、黏附分子和轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB屬于NF-κb/Rel家族蛋白的一員，能夠啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而參與一系列基因的調(diào)控和表達(dá)，在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腦缺血后誘導(dǎo)釋放NF-κB而促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Xu 等〔6〕研究報(bào)道基本一致。此外，有研究表明IFN-γ可活化P38激酶，誘導(dǎo)細(xì)胞因子及Ⅱ類組織相容性復(fù)合體(MHC)的表達(dá)，共同參與細(xì)胞的凋亡〔7〕。本研究也發(fā)現(xiàn)模型組中IFN-γ的含量水平及細(xì)胞凋亡數(shù)量相比假手術(shù)組顯著升高，我們推測IFN-γ在腦缺血再灌注損傷后形成細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動(dòng)劑能活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶而抑制NF-κB的激活〔8〕。國內(nèi)有研究報(bào)道，PGZ作為PPARγ特異性激動(dòng)劑，可促進(jìn)PPARγmRNA和蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)其對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用〔9〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PGZ可通過降低誘發(fā)NF-kB的釋放能力，進(jìn)而減少促炎介質(zhì)(IFN-γ)的含量水平，從而發(fā)揮增加健存神經(jīng)元而減少細(xì)胞凋亡的作用；若先給予GW9662〔10〕后再予PGZ處理，則可逆轉(zhuǎn)PGZ的上述保護(hù)作用；同樣，單獨(dú)行DMSO預(yù)處理后的大鼠在相關(guān)方面未得到明顯的改善。

本文提示PGZ具有阻止或延緩神經(jīng)細(xì)胞水腫壞死，對保護(hù)缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷具有積極意義，而GW9662則可逆轉(zhuǎn)PGZ抗細(xì)胞水腫壞死的效應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，吡格列酮可通過激活PPARγ負(fù)性調(diào)節(jié)腦組織中NF-κB的含量水平，進(jìn)一步減少促炎介質(zhì)(IFN-γ)的釋放，減輕了大鼠缺血再灌注后的細(xì)胞水腫，從而很好地增加健存神經(jīng)元而減少細(xì)胞凋亡。

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