Ghrelin對乙醇誘導(dǎo)大鼠急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用及其機制的研究*

蔣 淼 樊曉明

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院消化科(200540)

Ghrelin是由Kojima等[1]發(fā)現(xiàn)的一種腦腸肽，是迄今惟一的生長激素釋放激素受體(GHSR)的天然配體。研究發(fā)現(xiàn)ghrelin不僅具有增加食欲、促進(jìn)胃動力的作用[2]，同時還具有強大的胃黏膜保護(hù)作用[3-4]，其機制可能與一氧化氮(NO)和內(nèi)臟感覺神經(jīng)有關(guān)。多數(shù)胃感覺神經(jīng)中存在對辣椒素敏感的辣椒素受體，其接受刺激后能釋放降鈣基因相關(guān)肽、速激肽、P物質(zhì)等，從而促使血管內(nèi)皮細(xì)胞和胃黏膜內(nèi)皮細(xì)胞中NO的合成和釋放，增加胃黏膜微循環(huán)[5]。

本實驗通過乙醇誘導(dǎo)大鼠急性胃黏膜損傷模型，利用辣椒素拮抗劑capsazepine阻斷胃中對辣椒素敏感的辣椒素受體，同時測定eNOS、iNOS mRNA表達(dá)變化，旨在探討ghrelin對胃黏膜保護(hù)作用的可能機制。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

健康Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠64只(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)，體質(zhì)量200～250 g。75%乙醇(上海利康消毒高科技有限公司)。Ghrelin(GenScript公司)按10 μg/mL稀釋于注射用水，定容至20 mL。Capsazepine(Sigma公司)4 mg溶于10%乙醇溶液中，定容至10 mL。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)。PCR試劑盒(Ferments公司)。

二、研究方法

1. 大鼠分組和急性胃黏膜損傷模型的建立：64只大鼠隨機分為空白對照組、乙醇模型組、ghrelin組和capsazepine組，每組各16只，實驗前禁食24 h，自由飲水。大鼠腹腔注射0.9% NaCl溶液2 mL/kg 1 h后以1 mL/100 g 75%乙醇灌胃誘導(dǎo)急性胃黏膜損傷模型?？瞻讓φ战M腹腔注射0.9% NaCl溶液2 mL/kg；ghrelin組大鼠腹腔注射ghrelin 20 μg/kg； capsazepine組先腹腔注射ghrelin 20 μg/kg，15 min后腹腔注射capsazepine 1 mg/kg。1 h后，空白對照組予0.9% NaCl溶液1 mL/100 g灌胃，其余兩組大鼠均予75%乙醇 1 mL/100 g 灌胃。2 h后麻醉取胃行后續(xù)研究。

2. 大體觀察：肉眼觀察各組大鼠胃大體標(biāo)本。

3. 胃潰瘍指數(shù)：各組大鼠胃組織以4%甲醛溶液固定，沿胃大彎剪開，顯微鏡下觀察出血性病灶，采用測微尺計算胃黏膜損傷面積，正常胃黏膜記0分，點狀損傷記1分，病損小于1 mm記2分，1～2 mm記3分，2～3 mm記4分，依次類推，如損傷寬度大于2 mm，評分加倍，全胃評分的總和為胃潰瘍指數(shù)[6]。

4. 組織學(xué)觀察：取大鼠胃竇部組織，石蠟切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察黏膜損傷程度和炎性細(xì)胞浸潤程度。

5. RT-PCR法檢測eNOS和iNOS mRNA表達(dá)：根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫的基因序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成目的基因序列，eNOS引物序列上游：5′-ACC CCC GGC GCT ACG AAG AA-3′，下游：5′-TGG CAG CCG GAA GGA GGG AG-3′，片段長度320 bp；iNOS引物序列上游：5′-TGG CCA GGC TGG AAG CCG TA-3′，下游：5′-CGG GCA TCT GGT AGC CAG CG-3′，片段長度333 bp；以β-actin為內(nèi)參，上游：5′- CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，下游：5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′，片段長度150 bp。采用Trizol試劑提取全部胃竇黏膜組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，行1%瓊脂糖凝膠電泳，采用GENE凝膠圖像處理系統(tǒng)分析，以eNOS和iNOS基因表達(dá)量與β-actin基因表達(dá)量的比值作為目的基因的表達(dá)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、大體病理學(xué)改變

空白對照組大鼠胃黏膜完整，未見明顯糜爛潰瘍和出血。乙醇模型組胃黏膜呈暗紅色，部分甚至呈暗黑色，表面大片黏膜脫落，壞死，觸之易出血。Ghrelin組胃底和胃體上部黏膜部分斑片狀糜爛出血，黏膜基本完整。Capsazepine組胃底和胃體上部黏膜明顯糜爛出血，部分壞死，多處潰瘍；而胃體下部和胃竇黏膜基本完整，少量糜爛潰瘍(見圖1)。

二、胃潰瘍指數(shù)

空白對照組、ghrelin組大鼠胃潰瘍指數(shù)顯著低于乙醇模型組(P<0.01)；capsazepine組胃潰瘍指數(shù)顯著高于ghrelin組(P<0.01)，但仍顯著低于乙醇模型組(P=0.028)(見圖2)。

三、組織病理學(xué)觀察

空白對照組大鼠胃黏膜完整，胃小凹結(jié)構(gòu)排列整齊；乙醇模型組胃黏膜結(jié)構(gòu)排列紊亂，部分區(qū)域黏膜上皮層缺失，損傷多累及胃黏膜固有腺體；ghrelin組大部分胃黏膜結(jié)構(gòu)排列完整，部分胃固有腺體破壞，炎性細(xì)胞少見；capsazepine組胃黏膜各層排列尚整齊，但損傷累及胃小凹和胃固有腺體，可見變性壞死細(xì)胞，部分見出血和大量中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞聚集(見圖3)。

A：空白對照組；B：乙醇模型組；C：ghrelin組；D：capsazepine組

圖2 各組胃潰瘍指數(shù)比較

A：空白對照組；B：乙醇模型組；C：ghrelin組；D：capsazepine組

四、eNOS、iNOS mRNA表達(dá)

乙醇模型組、ghrelin組、capsazepine組eNOS mRNA表達(dá)均較空白對照組顯著升高(P<0.01)，ghrelin組eNOS mRNA表達(dá)較乙醇模型組顯著升高(P<0.01)，capsazepine組較ghrelin組顯著降低(P<0.01)，但與乙醇模型組無明顯差異(見圖4)。

乙醇模型組、ghrelin組、capsazepine組iNOS mRNA表達(dá)均較空白對照組顯著升高(P<0.01)，ghrelin組iNOS mRNA表達(dá)較乙醇模型組顯著降低(P<0.01)，capsazepine組較ghrelin組顯著升高(P<0.01)，而與乙醇模型組無明顯差異(見圖5)。

圖4 各組大鼠eNOS mRNA表達(dá)(RT-PCR法)

圖5 各組大鼠iNOS mRNA表達(dá)(RT-PCR法)

討 論

Ghrelin由28個氨基酸殘基組成[7]，主要來源于胃黏膜X/A樣細(xì)胞[8]。國外實驗已證實ghrelin具有胃黏膜保護(hù)作用，且與參與調(diào)控NOS/COXs的表達(dá)活性有關(guān)，但其作用機制尚不清楚[3-4]。

胃黏膜對急性應(yīng)激攻擊的反應(yīng)是由胃感覺神經(jīng)反射完成的，因此胃感覺神經(jīng)在保護(hù)胃黏膜的過程中起有重要作用[5]。脊髓傳入神經(jīng)為胃內(nèi)感覺神經(jīng)來源之一。多數(shù)胃脊髓傳入神經(jīng)纖維上存在辣椒素受體，這類神經(jīng)又稱為辣椒素-敏感感覺神經(jīng)(capsaicin-sensitive sensory neurons, CSSN)，其受刺激后能激活與受體直接偶聯(lián)的膜離子通道，引起神經(jīng)元及其纖維釋放降鈣基因相關(guān)肽、速激肽和P物質(zhì)，并向軸突末梢運輸這些肽類物質(zhì)，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞和胃黏膜內(nèi)皮細(xì)胞中NO的合成與釋放，NO進(jìn)一步與前列腺素(PG)相互作用，參與增加胃黏膜血流量、抑制炎癥反應(yīng)和維護(hù)碳酸氫鈉鹽屏障等作用，從而維持胃黏膜完整性和抵抗各種局部刺激。研究表明胃黏膜產(chǎn)生的ghrelin作為腦腸肽，可作用于胃外周神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的GHSR然后傳遞信號至中樞，產(chǎn)生各種效應(yīng)。ghrelin的胃黏膜保護(hù)作用也依賴于胃感覺神經(jīng)的完整性[9]，故推測ghrelin的胃黏膜保護(hù)作用可能與CSSN存在某種聯(lián)系。

Capsazepine作為辣椒素的異構(gòu)體能競爭性結(jié)合CSSN上的辣椒素受體，從而起抑制CSSN的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，ghrelin組大鼠大體和組織病理學(xué)改變較乙醇模型組明顯改善，胃潰瘍指數(shù)明顯降低；而加入capsazepine后，大鼠胃底和胃體上部黏膜明顯糜爛出血，部分壞死，多處潰瘍，呈暗紅色；病理結(jié)果示黏膜腺體破壞，細(xì)胞變性壞死，部分見出血，中性細(xì)胞聚集；且胃潰瘍指數(shù)明顯升高。說明capsazepine能減弱ghrelin對胃黏膜的保護(hù)作用。

近年研究表明NOS特異性阻斷劑L-NAME能阻斷ghrelin的胃黏膜保護(hù)作用[10]，說明ghrelin可能是通過NO介導(dǎo)產(chǎn)生胃黏膜保護(hù)作用。大量研究表明eNOS產(chǎn)生的NO能舒張血管平滑肌，增加胃黏膜血流，抑制白細(xì)胞移動和減輕黏膜炎癥反應(yīng)。而炎癥誘導(dǎo)的iNOS產(chǎn)生的NO具有細(xì)胞毒性作用，能產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞損傷。兩者共同參與胃黏膜的保護(hù)和炎癥反應(yīng)。本研究中，乙醇模型組iNOS mRNA表達(dá)較空白對照組顯著增加，表明iNOS表達(dá)增加后，產(chǎn)生大量誘導(dǎo)型NO，明顯加重胃黏膜損傷。Ghrelin組eNOS mRNA表達(dá)較乙醇模型組明顯增加，iNOS mRNA表達(dá)明顯下降，同時組織病理學(xué)和胃潰瘍指數(shù)亦明顯改善，表明ghrelin可能通過上調(diào)eNOS mRNA表達(dá)、抑制iNOS表達(dá)而減輕細(xì)胞損傷。而加入capsazepine后，eNOS mRNA表達(dá)較ghrelin組明顯下降，iNOS mRNA表達(dá)增強，且與乙醇模型組均無明顯差異，結(jié)合ghrelin組大體、組織學(xué)改變和胃潰瘍指數(shù)均明顯優(yōu)于capsazepine組的結(jié)果，說明capsazepine組胃黏膜損傷較ghrelin組嚴(yán)重的原因可能是capsazepine阻斷了ghrelin對NOS的調(diào)節(jié)作用，尤其是阻斷了ghrelin對iNOS的抑制作用。

總之，本實驗給予大鼠capsazepine抑制辣椒素受體后，ghrelin的胃黏膜保護(hù)作用減弱，血管源性eNOS mRNA表達(dá)較ghrelin組下降，而iNOS mRNA表達(dá)增強，表明ghrelin的胃黏膜保護(hù)作用可能由CSSN上的辣椒素受體介導(dǎo)。但其機制是通過胃脊髓傳入神經(jīng)和迷走神經(jīng)的胃壁內(nèi)短反射，還是通過脊髓傳入神經(jīng)和迷走神經(jīng)傳遞ghrelin信號至中樞下丘腦弓狀核等部位，然后通過神經(jīng)調(diào)節(jié)激活CSSN，目前尚不清楚，仍有待進(jìn)一步研究證實。

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9 Brzozowski T, Konturek PC, Drozdowicz D, et al. Role of central and peripheral ghrelin in the mechanism of gastric mucosal defence[J]. Inflammopharmacology, 2005, 13 (1-3): 45-62.

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