RhoA/ROCK信號(hào)通路在糖尿病結(jié)腸肌層中的表達(dá)

孫曉萌 朱 瀅 王慶娥 柏建安 林 琳

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科(210029)

胃腸動(dòng)力障礙是糖尿病(diabetes mellitus, DM)極為常見(jiàn)的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和降糖藥物的作用，其發(fā)病機(jī)制涉及氧化應(yīng)激[1]、腸神經(jīng)元減少[2]、糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products, AGEs)形成[3]、Cajal間質(zhì)細(xì)胞減少[4]等多個(gè)方面。但這些機(jī)制尚不能完全解釋DM胃腸動(dòng)力障礙的病因，隨著研究的深入，胃腸平滑肌肌源性因素在該病中的作用引起關(guān)注，其中平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell, SMC)自身病變起關(guān)鍵作用。RhoA/ROCK信號(hào)通路在體內(nèi)普遍存在，參與調(diào)節(jié)包括SMC在內(nèi)的多種細(xì)胞的功能。近年，RhoA/ROCK信號(hào)通路在DM并發(fā)癥中的作用引起了研究者的重視。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察比較血糖正常者以及DM患者結(jié)腸肌層中RhoA/ROCK信號(hào)通路主要信號(hào)分子的表達(dá)變化，旨在探討該信號(hào)通路在DM結(jié)腸動(dòng)力障礙發(fā)病中的可能作用。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

結(jié)腸組織標(biāo)本取自2012年9月-2013年12月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科行結(jié)腸癌根治術(shù)患者，收集距腫瘤邊緣5 cm以上的遠(yuǎn)端正常結(jié)腸組織。所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。根據(jù)糖化血紅蛋白水平，將所有研究對(duì)象分為對(duì)照組和DM組。對(duì)照組30例，為結(jié)腸癌無(wú)合并DM患者，其中男18例，女12例，平均年齡(59.1±10.0)歲；DM組22例，為結(jié)腸癌合并DM患者，DM均為Ⅱ型，其中男14例，女8例，平均年齡(67.2±10.0)歲。DM診斷依據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)。所有患者術(shù)前均未行放化療，均除外甲狀腺功能亢進(jìn)和糖皮質(zhì)激素類藥物使用史，排除既往有腹部手術(shù)史者。本研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選者均簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1. 免疫組化法：結(jié)腸組織常規(guī)包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)。加入兔抗RhoA一抗(工作濃度1∶100，Abcam公司)，4 ℃孵育過(guò)夜。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，室溫孵育45 min。加入二氨基聯(lián)苯胺顯色，自然水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。

結(jié)果判斷：胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為陽(yáng)性反應(yīng)。每張切片選擇5～10個(gè)高倍鏡視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析并計(jì)算RhoA陽(yáng)性細(xì)胞面積。

2. 蛋白質(zhì)印跡法：提取結(jié)腸平滑肌組織蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度，80 μg蛋白/泳道行SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白，隨后100 V恒壓將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入抗RhoA一抗(工作濃度1∶1 000，Abcam公司)、抗ROCK1一抗(工作濃度1∶1 000，SAB公司)、抗肌球蛋白磷酸酯酶靶點(diǎn)亞單位1(MYPT1)一抗(工作濃度1∶1 000，Cell Signaling Technology, Inc)、抗磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶點(diǎn)亞單位1(p-MYPT1)一抗(工作濃度1∶1 000，Cell Signaling Technology, Inc)和內(nèi)參β-actin(工作濃度1∶1 000，Biogot Biotechnology CO., Ltd)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，RhoA蛋白在對(duì)照組和DM患者結(jié)腸縱肌層和橫肌中均有分布，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；DM組RhoA蛋白陽(yáng)性染色面積較對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05

二、蛋白質(zhì)印跡結(jié)果

蛋白質(zhì)印跡法顯示，RhoA、ROCK1、MYPT1和p-MYPT1在正常結(jié)腸肌層中的表達(dá)灰度值分別為1.15±0.69、0.75±0.05、1.21±0.80和1.04±0.47，其中RhoA、ROCK1和p-MYPT1蛋白的灰度值較DM組(0.62±0.42、0.54±0.09和0.70±0.28)明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而MYPT1蛋白的灰度值無(wú)明顯差異(1.21±0.80對(duì)0.94±0.50，P>0.05)(圖2)。

討 論

胃腸動(dòng)力障礙是DM極為常見(jiàn)的并發(fā)癥，約75%的DM患者伴有胃腸道癥狀[1,5]，其中便秘為最常見(jiàn)的癥狀[6]，其病理生理學(xué)特點(diǎn)為結(jié)腸張力和收縮力減弱、蠕動(dòng)減慢、排空延遲等。目前DM胃腸動(dòng)力障礙的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，多認(rèn)為與自主神經(jīng)病變、胃腸激素、微血管病變等有關(guān)；近年研究認(rèn)為胃腸平滑肌肌源性因素對(duì)該病的發(fā)生亦有重要作用。

G蛋白(即鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白)是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最為經(jīng)典的信號(hào)分子之一，分為兩類：一類是與膜受體耦合的異三聚體G蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；另一類稱為小分子G蛋白，因其分子質(zhì)量在20～30 kDa 之間而得名。RhoA是小分子G蛋白R(shí)ho亞家族中研究最多、最為清楚的成員之一，分布于大多數(shù)具有收縮功能的細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、SMC等[7]。RhoA蛋白常以非活化的RhoA-GDP形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到細(xì)胞外刺激信號(hào)如磷脂酶C等的作用時(shí)，GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP，RhoA-GDP因此活化成RhoA-GTP，并且轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜中[8]。ROCK是RhoA蛋白下游最主要的效應(yīng)分子[9]，是一種分子質(zhì)量約為160 kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。ROCK包含ROCK1和ROCK2兩種亞型，其中ROCK1廣泛分布于各種人體組織中，而ROCK2主要分布于骨骼肌和腦組織中[10-11]。

目前已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞外刺激因素可誘導(dǎo)RhoA/ROCK通路活化，活化后的RhoA/ROCK通路可與多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能，包括細(xì)胞收縮、細(xì)胞分化、基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡等。RhoA/ROCK信號(hào)通路激活對(duì)于不同組織的細(xì)胞可產(chǎn)生不同的效應(yīng)，其中對(duì)平滑肌組織的生物學(xué)效應(yīng)主要是調(diào)節(jié)SMC收縮。

SMC收縮是一個(gè)復(fù)雜事件，其中肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)的磷酸化水平是決定收縮程度的關(guān)鍵因素之一。MLC的磷酸化水平受鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)和鈣離子非依賴的肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase, MLCP)的雙重調(diào)節(jié)。MLCK磷酸化MLC，導(dǎo)致平滑肌收縮；MLCP通過(guò)其亞單位與已磷酸化的MLC結(jié)合，使其去磷酸化，引起平滑肌舒張。MLCP的抑制可使磷酸化MLC表達(dá)和平滑肌收縮進(jìn)一步增強(qiáng)，這種現(xiàn)象稱之為“鈣敏化”。近年，鈣敏化的具體機(jī)制成為研究熱點(diǎn)，已證實(shí)RhoA及其底物ROCK是介導(dǎo)鈣敏化的主要因素?；罨蟮腞OCK可通過(guò)直接磷酸化MLC和抑制MLCP活性雙重途徑來(lái)調(diào)節(jié)平滑肌收縮。其中ROCK主要通過(guò)兩條途徑抑制MLCP活性，其一是通過(guò)磷酸化MLCP的調(diào)節(jié)亞單位MYPT1，使其失去催化MLC脫磷酸化的能力，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)磷酸化MLC水平提升，平滑肌收縮；因此，p-MYPT1的表達(dá)水平常被認(rèn)為是ROCK活性的重要標(biāo)志。另一條途徑是ROCK通過(guò)磷酸化一種平滑肌特異性磷蛋白CPI-17，使其發(fā)生一系列構(gòu)象改變而抑制MLCP活性。

1 Da=0.992 1 u

研究證實(shí)，高血糖可引起一系列的代謝紊亂，包括蛋白質(zhì)的非酶糖化、氧化應(yīng)激以及一些信號(hào)通路的異常。近年RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在DM并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展中的作用引起人們的重視，但目前該信號(hào)通路與DM并發(fā)癥關(guān)系的研究主要集中在神經(jīng)、心血管以及腎臟等系統(tǒng)病變，在胃腸病變中的研究較少。平滑肌是維持胃腸運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)，胃腸動(dòng)力性疾病的發(fā)生與平滑肌收縮性的改變密切相關(guān)。Bhetwal等[12]探討平滑肌病變與DM胃輕癱的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，DM胃輕癱小鼠胃平滑肌組織中ROCK的表達(dá)減少，推測(cè)DM胃輕癱的發(fā)生可能部分與RhoA/ROCK信號(hào)通路被抑制有關(guān)；研究[13]還表明，在結(jié)腸炎等疾病狀態(tài)下存在腸運(yùn)動(dòng)紊亂時(shí)，一些鈣敏感蛋白如MYPT1和CPI-17的表達(dá)異常。但迄今尚缺乏RhoA/ROCK信號(hào)通路活性改變對(duì)DM結(jié)腸動(dòng)力影響的報(bào)道。

文獻(xiàn)報(bào)道，約60%的DM患者存在結(jié)腸動(dòng)力障礙[14]。本研究的前期研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，DM大鼠結(jié)腸平滑肌收縮性減弱，結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間延遲；同時(shí)DM大鼠結(jié)腸平滑肌組織中MLC的磷酸化表達(dá)減少。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，DM結(jié)腸肌層中RhoA蛋白和ROCK1蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，提示RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑表達(dá)下調(diào)；p-MYPT1蛋白表達(dá)減少，進(jìn)一步表明RhoA/ROCK信號(hào)通路活性被抑制，由此推測(cè)DM結(jié)腸組織內(nèi)RhoA/ROCK信號(hào)通路活性被抑制以及由此導(dǎo)致的MLC磷酸化表達(dá)減少可能與DM結(jié)腸動(dòng)力障礙有一定相關(guān)性。但由于本研究所納入對(duì)象均未行結(jié)腸動(dòng)力測(cè)定，缺乏臨床動(dòng)力學(xué)參數(shù)，尚無(wú)法判斷該信號(hào)通路的活性變化與DM結(jié)腸動(dòng)力障礙的確切關(guān)系，還有待于DM動(dòng)物模型以及細(xì)胞水平的進(jìn)一步研究探討。

AGEs是蛋白質(zhì)和脂類非酶糖基化后生成的多種不同物質(zhì)的統(tǒng)稱，廣泛存在于血液和各種組織中。正常人體內(nèi)AGEs水平隨年齡增長(zhǎng)緩慢增加，但在DM狀態(tài)下，AGEs能加速形成。通過(guò)對(duì)DM患者或DM動(dòng)物模型的研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，DM血清或結(jié)腸組織中AGEs水平均顯著升高。AGEs與DM的多種并發(fā)癥密切相關(guān)，其可通過(guò)氧化應(yīng)激、糖基化修飾某些蛋白等受體依賴性和非依賴性途徑促進(jìn)DM并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[19]。RAGE是第一個(gè)被報(bào)道的AGEs受體，屬免疫球蛋白超家族成員。AGEs及其受體RAGE已被作為DM并發(fā)癥的重要病理機(jī)制[20]，包括心臟病[21]、腎病[22]、視網(wǎng)膜病變[23]等。根據(jù)對(duì)組織器官的影響，AGEs及其受體RAGE可能參與介導(dǎo)了DM胃腸道并發(fā)癥的發(fā)生，但具體機(jī)制目前尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，SMC、內(nèi)皮細(xì)胞等均表達(dá)RAGE。本研究的前期研究[16]提示，AGEs能抑制結(jié)腸SMC內(nèi)MLC的磷酸化，結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)AGEs可能部分通過(guò)抑制結(jié)腸肌層組織中RhoA/ROCK信號(hào)通路活性引起MLC的磷酸化減少，最終導(dǎo)致平滑肌收縮減弱、結(jié)腸動(dòng)力障礙。但AGEs是否可抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路以及AGEs是否通過(guò)RAGE受體等受體依賴途徑抑制該信號(hào)通路等均有待于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步探討。

綜上所述，RhoA/ROCK信號(hào)通路活性下降可能與DM結(jié)腸動(dòng)力障礙有關(guān)，但DM時(shí)該通路活性改變的具體機(jī)制尚未完全闡明，有待繼續(xù)研究。隨著基礎(chǔ)研究的進(jìn)一步深入以及臨床經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，DM合并便秘的治療方法必將進(jìn)一步完善，從而提高療效。

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