槲皮素對(duì)前列腺癌細(xì)胞熱休克蛋白27表達(dá)的影響

于 峰，姜麗麗，邸彥橙

牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院泌尿外科，黑龍江牡丹江157011

熱休克蛋白 (heat shock protein，HSP)作為分子伴侶廣泛存在于原核與真核細(xì)胞體內(nèi)，可參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的調(diào)控以及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等重要的生物學(xué)過程，是生物體內(nèi)具有廣泛和重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)［1］。HSP27是HSP亞家族成員之一，在多種腫瘤細(xì)胞中均有過表達(dá)，其主要生物學(xué)功能是防止各種應(yīng)激因素對(duì)細(xì)胞的損傷，HSP27還與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)［2］。前列腺癌是男性中發(fā)病較高的腫瘤之一，有研究證實(shí)，黃酮、多酚類化合物是預(yù)防治療前列腺癌很有潛力的藥物。目前，HSP27與腫瘤的關(guān)系日益受到重視，但有關(guān)HSP27在前列腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中所起作用的報(bào)道較少。槲皮素是一種黃酮類化合物，在自然界中廣泛存在，除具有多種生物學(xué)活性外，還可通過多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡等，發(fā)揮抗腫瘤活性［3］。本研究觀察了HSP27在不同惡性程度前列腺癌細(xì)胞株RWPE-1、LNCaP、PC-3和TSU-Pr1中的表達(dá)情況，分析了槲皮素對(duì)PC-3細(xì)胞株HSP27表達(dá)的影響。

材料和方法

材料槲皮素購自美國Sigma公司，使用二甲基亞砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO)分別配制成0.3 mg/ml(半數(shù)有效量［4］)和0.6 mg/ml溶液，置于 -20℃冰箱保存?zhèn)溆?。人前列腺癌?xì)胞株RWPE-1、LNCaP、PC-3和TSU-Pr1購自上海艾研生物科技有限公司。所有細(xì)胞株分別分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、槲皮素高劑量組 (給予0.6 mg/ml槲皮素150 μl)和槲皮素低劑量組 (給予0.3 mg/ml槲皮素150 μl)4組。

細(xì)胞培養(yǎng)RWPE-1、LNCaP、PC-3和TSU-Pr1細(xì)胞分別保存于含有10%胎牛血清的F12營養(yǎng)培養(yǎng)基(含青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml)，以1×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)每一個(gè)步驟至少重復(fù)4次。

槲皮素治療待80%細(xì)胞融合后，更換新鮮培養(yǎng)液，加入不同濃度槲皮素，空白對(duì)照組不給藥，陰性對(duì)照組給予等體積DMSO。

免疫熒光染色常規(guī)方法收獲細(xì)胞，胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，PBS沖洗后，TCM-N3沖洗，50 ml錐形管2000 r/min(r=8.5 cm)離心10 min。將上清液吸出并重新懸浮于1 ml TCM-N3，滴于載玻片 (多聚賴氨酸包被)上吹干，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌5 min，共5次。滴加5 g/L BSA封閉液，37℃封閉30 min，加入相應(yīng)的一抗，兔抗小鼠 HMGBl抗體(1∶200)，PBS洗滌5 min，共5次。加入熒光標(biāo)記的二抗，PE標(biāo)記的驢抗兔lgG(1∶500)，避光，37℃孵育2 h，PBS洗滌5 min，共5次。Hoechst 33342染料避光37℃孵育15 min，PBS洗滌，共3次。緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察、拍照并保存。

RT-PCR檢測(cè)HSP27 mRNA的表達(dá)TRIzol試劑盒抽提總 RNA，溶于 20 μl DEPC-H2O，依次加入2.5 μl DNA 酶、2.5 μl 10 × buffer，37 ℃ 水浴 30 min后，65℃水浴10 min，分光光度法檢測(cè)RNA濃度。HSP27 PCR引物:5’-AAGGAAATTCAAAATGCTGTCAA-3’(正向)和 5’-ACAGACAAGATCTCCCGGCACTT-3’(反向);GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物:5’-GGTCAACGGGTAGGTGTTTG-3’(正向)和 5’-GCCTTTGGGCTCTGCATGAA-3’(反向)。HSP27 PCR反應(yīng)總體積25 μl。采用Gene-Am P2400熱循環(huán)儀，預(yù)變性94℃5 min;變性94℃30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃30 s，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳 (110V，35 mA，30 min)，溴化乙錠染色，BandScan 5.0軟件進(jìn)行電泳結(jié)果吸光度積分值分析，HSP27 mRNA表達(dá)相對(duì)含量值 (灰度比)=HSP27吸光度積分值/GAPDH吸光度積分值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

HSP27在各細(xì)胞株的表達(dá)情況免疫熒光染色結(jié)果顯示，HSP27在各細(xì)胞株的染色強(qiáng)度，按照RWPE-1＜LNCaP＜PC-3＜TSU-Pr1順序依次增強(qiáng) (圖1)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，RWPE-1、LNCaP、PC-3和TSU-Pr1細(xì)胞株HSP27 mRNA的表達(dá)水平分別為90%、100%、115%和148%(圖2)。

槲皮素對(duì)HSP27 mRNA表達(dá)的影響空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、槲皮素高劑量組和槲皮素低劑量組PC-3細(xì)胞的HSP27 mRNA表達(dá)水平分別為128%、110%、50%、60%，其中，槲皮素高劑量組和槲皮素低劑量組的表達(dá)均明顯低于空白對(duì)照組 (P均＜0.05)(圖3)。

圖1 各細(xì)胞株免疫熒光染色結(jié)果 (×400)Fig 1 Immunofluorescence staining results of different cell lines(×400)

圖2 RT-PCR檢測(cè)RWPE-1、LNCaP、PC-3和TSU-Pr1細(xì)胞株HSP27 mRNA的表達(dá)結(jié)果Fig 2 Expressions of HSP27 mRNA in the cell lines RWPE-1，LNCaP，PC-3，and TSU-Pr，as shown by RT-PCR

圖3 槲皮素對(duì)HSP27 mRNA表達(dá)的影響Fig 3 Effect of quereetin on the HSP27 mRNA expression

討 論

HSP是應(yīng)激條件下產(chǎn)生的高度保守的分子伴侶［5］，是組織和器官受到刺激或應(yīng)激時(shí)表達(dá)的主要蛋白質(zhì)，可參與細(xì)胞損傷、防御、修護(hù)產(chǎn)生而控制細(xì)胞功能［6］。HSP的表達(dá)不僅抑制細(xì)胞損傷，而且對(duì)細(xì)胞的保護(hù)也起著重要作用，例如控制細(xì)胞凋亡和腫瘤免疫反應(yīng)［7］。已知正常組織細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)水平很低，應(yīng)激狀態(tài)則可導(dǎo)致胞內(nèi)HSP27磷酸化并造成其寡聚體解聚，HSP27表達(dá)上調(diào)。研究顯示，HSP27在腫瘤發(fā)病中的作用與其對(duì)細(xì)胞的影響有關(guān)，它在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中可與相關(guān)活性蛋白相互作用并抑制凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞凋亡，參與癌癥發(fā)生，其在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)增加，并與腫瘤的惡性程度及預(yù)后有關(guān)［8-9］。HSP27可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖分化及細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與腫瘤的發(fā)生、侵襲以及轉(zhuǎn)移過程［10］。Miyake 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，HSP27、HSP70和HSP90可在前列腺癌細(xì)胞表達(dá)，但根據(jù)Gleason評(píng)分和病理分期，只有HSP27表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HSP27可作為前列腺癌預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。Thomas等［12］研究顯示，前列腺癌組織中不同細(xì)胞HSP27的著色強(qiáng)度有所不同，具有明顯的異質(zhì)性，HSP27的表達(dá)水平隨著癌組織分化程度的增高而增高。本研究結(jié)果顯示，HSP27的表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞的分級(jí)呈正相關(guān)，即前列腺癌細(xì)胞分級(jí)越高，其表達(dá)水平也就越高，說明癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、惡變、侵襲力等因素與HSP27的表達(dá)水平相關(guān)。

槲皮素是一種廣泛存在于水果、蔬菜和中草藥，如槐米、金蕎麥、銀杏葉等中的天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗血小板聚集、清除自由基和抗氧化等多種生物活性。方武等［4］研究證實(shí)，槲皮素可抑制白血病、結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、膀肌癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長和癌細(xì)胞DNA的生物合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。劉麗娜等［13］研究發(fā)現(xiàn)，HSP27在前列腺癌組中的表達(dá)陽性率高于前列腺上皮內(nèi)瘤變組和前列腺增生組，且在前列腺上皮內(nèi)瘤變組中的表達(dá)陽性率又高于前列腺增生組，提示隨著前列腺病變的演變，HSP27的表達(dá)陽性率不斷升高，并進(jìn)一步推測(cè)，HSP27有可能參與了前列腺癌的演變過程。PC-3細(xì)胞來源于人前列腺癌上皮，具有低轉(zhuǎn)移能力，是良好的實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)胞株［14］。本研究觀察了槲皮素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，槲皮素可以抑制HSP27的表達(dá)，隨著劑量增加，抑制作用增強(qiáng)，由此推測(cè)，槲皮素抑制HSP27的表達(dá)可能是其抗前列腺癌的機(jī)制之一。

［1］劉世敏，李解方.HSP27在前列腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義［J］.中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2013，41(3):247-252.

［2］Roeehi P，So A，K0jima S，et a1.Heat shock protein 27 inereases after androgen ablation and plays a cytoproteetive role in hormone refractory prostate cancer ［J］.Cancer Res，2004，64(18):6595-6602.

［3］苑輝卿，楊玲玲，姜安麗，等.槲皮素對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)錄因子Spl功能的抑制作用［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2005，21(5):673-678.

［4］方武，劉揚(yáng)保，高淑華，等.槲皮素對(duì)前列腺癌細(xì)胞的放療增敏性研究［J］.四川醫(yī)學(xué)，2012，33(4):591-593.

［5］李弘夏，謝智欽，杜立.基于HSP27的乳腺癌干細(xì)胞靶向治療研究進(jìn)展 ［J］.中國老年學(xué)雜志，2014，34(2):561-563.

［6］Okazaki M，Shimizu Y，Chiba M，et al.Expression of heat shock proteins induced by cyclical tretching stress in human periodontal ligament fibroblasts ［J］.Tohoku Univ Dent J，2000，19:108-115.

［7］Garrido C，Gurbuxani S，Ravagnan L，et al.Heat shock proteins:endogenous modulators of apoptotic cell death ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，286(3):433-442.

［8］陳霞，袁國躍，王東.熱休克蛋白27、轉(zhuǎn)化生長因子-β1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，23(6):517-519.

［9］黃琳淋，李光迪.甲胎蛋白異質(zhì)體3、高爾基體蛋白73及熱休克蛋白27在原發(fā)性肝癌中的診斷價(jià)值［J］.中外醫(yī)療，2013，32(13):26-28.

［10］李偉，江其生.熱休克蛋白27與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.腫瘤研究與臨床，2009，21(6):430-431.

［11］Miyake H，Muramaki M，Kurahashi T，et al.Expression of potential molecular markers in prostate cancer:correlation with clinicopathological outcomes in patients undergoing radical prostatectomy ［J］.Urol Oncol，2010，28(2):145-151.

［12］Thomas SA，Brown IL，Hollins GW，et a1.Detection and distribution of heat shock protein 27 and 90 in human benign and malignant prostatic tissue ［J］.Br J Urol，1996，77(3):367-372.

［13］劉麗娜，牛曉東，李偉，等.熱休克蛋白27在前列腺癌中的表達(dá)及臨床意義 ［J］.解放軍醫(yī)藥雜志，2012，24(8):20-22.

［14］張軼庠，張朝霞，黃東龍，等.HSP27在人不同轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞株比較蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究 ［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(35):19-25.