異甘草素對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經保護作用的實驗研究

楊永明，荔志云

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 神經外科，甘肅 蘭州，730050)

近年來交通事故和地震等自然災害引起的創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)呈上升趨勢。腦創(chuàng)傷后，損傷灶部位腦組織產生大量的自由基和炎癥介質引起神經元水腫和壞死是導致繼發(fā)性腦損傷的一個重要原因。中藥干草的提取物異甘草(ISL)具有較為廣泛的藥理活性，其在神經損傷修復方面有多種作用[1]，本實驗通過異ISL對創(chuàng)傷性腦損傷的大鼠進行干預探討其治療機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

SPF級Wistar 雄性大鼠45只，由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實驗科提供，鼠齡2～3個月，體質量150～200 g，異甘草素(純度98%)(上海源葉生物科技公司提供)，SOD和MDA檢測試劑盒(南京建成試劑公司)，IL-6 TNF-α檢測試劑盒(上海豐翔生物科技有限公司)，超低溫冰箱(日本三洋公司)，低速離心機(北京醫(yī)用離心機公司)，直接讀數分析天平(日本島津公司)，全自動酶標儀(中國南京華東電子廠)，分光光度計(上海天美科學儀器廠)，恒溫水浴箱(上海喬楓實業(yè)公司)，顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 腦外傷模型制作

參照Feeney法[2]，自制打擊器，由撞桿、下落打擊棒和金屬套管3部分組成。打擊棒重30 g，下落高度30 cm，直徑3 mm，打擊深度為3 mm。大鼠用10%水合氯醛(30 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，固定頭部，消毒后于矢狀正中線切開頭皮，分離軟組織及骨膜，用小型電鉆在左頂葉上方開直徑約4 mm的骨窗，并保持硬膜完整。保持硬腦膜的完整。將打擊裝置垂直固定于大鼠的腦表面，打擊棒沿金屬套管從30 cm高度打擊大鼠頭部致傷(沖擊力為900帕斯卡)造成左側大腦半球局部腦挫裂傷損傷。充分止血后，予以碘附清洗傷口并縫合頭皮，假手術組僅開骨窗不打擊。大鼠出現短暫的四肢抽搐，呼吸暫停為造模成功。

1.3 動物分組及給藥

隨機數字表法分為假手術組、腦外傷組、異甘草素組，每組15只。依據預實驗時得到的最佳異甘草素濃度，術后2 h添加異甘草素組給予異甘草素30 mg/kg腹腔注射治療1次/d，腦外傷組和假手術組等量的腹腔注射治1次/d，共治療5 d。

1.4 干濕比重法腦含水量檢測

實驗動物于TBI后第5天，各組任取5只大鼠每只經10%水合氯醛2 mL腹腔注射過量麻醉后斷頭處死，取大鼠損傷側腦組織體積約0.5 mL，去除凝血，用冰冷生理鹽水沖洗腦組織表面血跡，濾紙吸去腦組織表面殘余水分，用電子天平測其濕重，然后于60 ℃通風烘烤箱烘烤96 h，取出稱干重，計算含水量：腦水含量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5 腦組織SOD及MDA含量、TNF-α和IL-6的檢測。

實驗動物于TBI后第5天，各組隨機取5只大鼠，每只經10%水合氯醛2 mL腹腔注射過量麻醉后迅速斷頭取腦， 用冰冷生理鹽水沖洗腦組織表面血跡，濾紙吸去腦組織表面殘余水分，取受打擊部位腦組織約0.2 mL用電子天平測其重量后加入9倍體積的PBS緩沖液制作損傷大腦皮層勻漿，離心后提取上清液按照說明書步驟進行腦組織勻漿液SOD及MDA，IL-6和TNF-α檢測。

1.6 病理切片觀察腦皮層及損傷灶組織形態(tài)變化

實驗動物于TBI后第5天，各組隨機取5只大鼠，每只經10%水合氯醛2 mL腹腔注射過量麻醉后切開胸腔，經左心室用生理鹽水沖至上腔靜脈流出液體清亮后再用4%的多聚甲醛沖洗3次，內固定后取腦用冷生理鹽水沖洗腦組織表面血跡，濾紙吸去腦組織表面殘余水分，浸入4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，以損傷灶中心制作腦組織矢狀位切片片厚3 μm，HE染色顯微鏡放大50倍觀察腦皮層及損傷灶組織形態(tài)學病理變化。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SSPS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 腦組織含水量、SOD、MDA、IL-6、TNF-α檢測結果

在TBI后第7天，腦外傷組大鼠腦組織水含量顯著高于假手術組，SOD含量顯著低于假手術組，MDA含量顯著高于假手術組、IL-6含量顯著高于假手術組，TNF-α含量顯著高于假手術組(P<0.01)，SOD活性均顯著低于A組(P<0.01); 異甘草素組腦組織含水量低于腦外傷組、異甘草素組腦組織SOD含量高于腦外傷組，MDA含量顯著低于腦外傷組，IL-6含量顯著低于腦外傷組，TNF-α含量顯著高于腦外傷組(P<0.01)。見表1。

表1 異甘草素對腦外傷大鼠腦組織含水量和細胞因子及氧化應激指標的影響

2.2 腦皮層組織形態(tài)學觀察

A組腦皮層細胞均勻分布，細胞密集，軟腦膜連續(xù)且完整；B組腦皮層打擊灶形成以腦軟化灶，創(chuàng)面凹陷，細胞數目明顯稀疏，半透明水腫帶超出損傷灶延伸至海馬，軟腦膜膜缺損；C組腦皮層損傷灶細胞數明顯增多，傷口已被肉芽組織填平，軟腦膜已經形成，并與正常腦組織入腦膜相續(xù)，半透明水腫帶較B組窄，水腫帶主要局限在損傷灶底部。見圖1。

3 討 論

腦損傷后氧化應激是加重繼發(fā)性腦損傷的重要機制，腦組織損傷后活性氧如超氧陰離子自由基(O2-)，過氧亞硝基陰離子，羥基自由基可導致組織破壞和細胞死亡。氧化應激可以使細胞直接死亡，還可成誘導凋亡程序啟動，加重腦損傷。Smith J等[3]報道創(chuàng)傷性腦損傷，創(chuàng)傷性脊髓損傷和缺血性腦損傷均可引起氧化應激反應，產生脂質過氧化，蛋白質氧化等，并可以損傷DNA，導致神經細胞死亡。SOD能催化超氧化物歧化成氧和過氧化氫，MDA是脂質氧化產物，二者成負相關，聯合檢測可以準確地反映組織氧化應激反應水平，可以衡量藥物抗氧化應激的有效性[4]。腦水腫是創(chuàng)傷性顱腦損傷一個重要的病理機制，是顱內壓增高的主要原因[5]。創(chuàng)傷性腦損傷后，血管壁破壞，血液進入組織間隙，引起血管性腦水腫，損傷區(qū)血供減少細胞缺血引起細胞鈉鉀泵轉運障礙，細胞內鈉離子聚集導致細胞水腫，顱內特殊結構系統(tǒng)的損傷可引起腦脊液回流障礙導致腦積水，以上因素均可使顱內壓升高，對生命造成巨大威脅。創(chuàng)傷性腦損傷后小膠質細胞和星形膠質細胞的激活早期TNF-α等細胞炎癥因子便有升高[6]。Herz J等[7]報道IL-6和TNF-α水平增高可引起炎性細胞聚集，血管通透性增高，加重腦組織損傷。Laird MD等[8]研究顯示小膠質細胞過多表達IL-6可促進星形膠質細胞水通道蛋白AQP4表達加重腦水腫。

本實驗發(fā)現TBI大鼠經異甘草治療5 d后，ISL治療組腦水腫較腦外傷組明顯減輕。腦皮層病理切片放大50觀察異甘草素治療組損傷灶周圍水腫帶明顯小于腦外傷組，損傷灶肉芽組織增生明顯多于腦外傷組。ISL組損傷灶已經被肉芽組織完全充填，軟腦膜已經形成并且大鼠前爪肌力改善。實驗中可見ISL組SOD活性明顯高于腦外傷組，ISL組腦組織MDA含量、IL-6和TNF-α含量、腦組織含水量低于腦外傷組，ISL組病理組織形態(tài)學觀察好于腦外傷組。中藥甘草的提取物異甘草素具有多中藥理活性。大量文獻[9]報道，異甘草素有較強的抗氧化活性以減少活性氧的產生，降低CASPAS-3的表達，提高組織BACL-2的表達 減低Ca離子聚集，保護腦皮層細胞，防治神經退行性疾病。異甘草素通過改善腦的能量代謝，抗氧化的作用保護缺血再灌注損傷后的腦組織[10]。異甘草素具抗脂質過氧化[11]、有松弛血管[12]、抑制血小板聚集、抗病毒、抗腫瘤[13]及雌激素樣活性[14]、抗細胞凋亡[15-16]等多種藥理作用。Jeon JP等[17]研究發(fā)現ISL可以通過調節(jié)蛋白質代謝，信號轉導，蛋白質折疊和運輸，氧化應激，降低可卡因誘導的神經元毒性作用保護腦組織。Zhan C等[18]研究發(fā)現異甘草素可以通過增加ATP的儲備，改善腦組織能量代謝，保護對小鼠局灶性缺血的腦組織。楊永明、荔志云[19-20]報道異甘草素可以通過調節(jié)細胞因子促進TBI大鼠康復。本實驗發(fā)現異甘草具有上調腦組織SOD的活性、減少MDA的生成、降低IL-6和TNF-α的含量，減輕腦水腫，改善大鼠前爪肌力，促進腦組織創(chuàng)面的愈合，對TBI大鼠具有顯著地神經保護作用，其在腦組織其他方面的作用值得進一步研究。

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