蒿甲醚對人惡性膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用

胡 宜, 王英濱,3, 薛一雪, 王 萍, 劉云會

(1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 神經(jīng)外科, 遼寧 沈陽, 110001;2.中國醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 神經(jīng)生物教研室, 遼寧 沈陽, 110001;3.沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院 神經(jīng)外科, 遼寧 沈陽, 110001)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有侵襲性生長的特點，治療困難，極易復(fù)發(fā)，預(yù)后很差[1]。傳統(tǒng)治療方法是手術(shù)切除，但術(shù)后平均生存期僅6個月，2年生存率不到7.5%[2]。因此放化療已經(jīng)成為膠質(zhì)瘤的標準輔助治療措施[2-4]。然而膠質(zhì)瘤，特別是高級別的膠質(zhì)瘤往往對普遍采用的化療措施具有抵抗性[4-5]。因此尋找新的、更為有效的化療藥物對膠質(zhì)瘤的治療十分重要。蒿甲醚是廣泛應(yīng)用于抗瘧疾治療的中草藥提取物[6]。近年來發(fā)現(xiàn)蒿甲醚可透過血腦屏障[7-8]，同時具有抗腫瘤作用[9-11]。本研究中，作者通過調(diào)查蒿甲醚對U251人膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡及磷酸Akt表達的作用，探討其對膠質(zhì)瘤的抑制作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

U251膠質(zhì)瘤細胞株來自中國醫(yī)科大學神經(jīng)生物教研室。培養(yǎng)條件為含有10%胎牛血清(天津灝洋生物技術(shù)有限公司)的DMEM-F12培養(yǎng)基(Hyclone，USA), 37 ℃, 5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 MTT法測定細胞增殖活性

利用MTT法測定U251細胞的增殖活性[12]。取對數(shù)生長期的細胞，0.25%的胰蛋白酶消化制成單細胞懸液。以5 000個/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)12 h后吸去培養(yǎng)液，對照組加入無血清DMEM-F12培養(yǎng)基；實驗組分別加入含濃度為0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 μmol/L的蒿甲醚(云南昆明制藥廠)。培養(yǎng)24、48 h后加入20 μL MTT (5 mg/mL) 。繼續(xù)孵育4 h，棄孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO，震蕩10 min。利用酶標儀測定波長490 nm時各孔光吸收值。

1.3 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡

U251細胞的凋亡通過Annexin V-FITC/PI試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)測定。取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，加入濃度為0 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L, 800 μmol/L的蒿甲醚培養(yǎng)48 h, 用0.25%的胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液制成單細胞懸液。PBS洗滌2次后離心(1 000 rpm, 5 min)，收集5×105個細胞，加入500 μL的BindingBuffer懸浮細胞。利用5 μL Annexin V-FITC和5 μL PropidiumIodide室溫避光染色15 min。在流式細胞儀上檢測，左下象限LL代表正常細胞(Annexin V-, PI-), 左上象限UL代表細胞收集過程中的損傷細胞(Annexin V-, PI+), 右上象限UR代表晚期凋亡細胞和壞死細胞(Annexin V+, PI+); 右下象限LR代表早期凋亡細胞(Annexin V+, PI-)。

1.4 蛋白印跡(Western blot)

細胞分組及培養(yǎng)同前。U251細胞以預(yù)先冰冷的PBS沖洗3次，利用細胞刮刀收集于離心管中，加入適量RIPA裂解液(碧云天)，冰上裂解30 min，然后超聲粉碎。4 ℃條件下以17 000 g離心60 min, 含有蛋白的上清被收集到新管中。以牛血清白蛋白為標準，利用BCA試劑盒(碧云天)測定蛋白濃度。蛋白上樣量為25 μg, 利用10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)凝膠電泳進行蛋白分離。轉(zhuǎn)膜后以山羊抗人Akt1/2多克隆抗體，兔抗人p-Akt 1/2/3 (Ser473)多克隆抗體及小鼠抗人β-actin多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)封閉過夜。兔抗山羊、山羊抗兔及山羊抗小鼠的辣根過氧化物酶標記的二抗(中山金橋生物技術(shù)公司)按1∶5 000比例稀釋后室溫孵育2 h，利用ChemiImager 5500 V2.03軟件檢測，并測定積分光密度值，計算目的基因與β-actin的積分光密度相對比值并進行數(shù)學統(tǒng)計。

2 結(jié) 果

2.1 蒿甲醚抑制U251細胞的增殖

作者利用不同濃度的蒿甲醚孵育U251細胞，然后以MTT法測定細胞增殖活力。結(jié)果顯示蒿甲醚以劑量依賴的方式抑制U251細胞生長；蒿甲醚處理U251細胞48 h，在400 μmol/L及更高濃度組細胞增殖活性受到顯著抑制，并且隨著濃度增高抑制作用增強。作用時間為24 h的IC50為(868.47±9.2) μmol/L，48 h的IC50為(384.81±13.8) μmol/L。見圖1。

圖1 不同濃度蒿甲醚對U251細胞增殖能力的影響

2.2 蒿甲醚促進U251細胞的凋亡

作者利用濃度為0 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L, 800 μmol/L的蒿甲醚作用于U251細胞48 h后，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測細胞凋亡，檢測蒿甲醚對U251膠質(zhì)瘤細胞凋亡能力的影響。結(jié)果顯示，各組凋亡率分別為(4.87±0.62)%, (8.12±0.65)%, (13.86±9.05)%, (18.55±0.92)%(圖2)。與對照組相比, 200 μmol/L, 400 μmol/L和800 μmol/L的蒿甲醚顯著促進U251細胞的凋亡，并且濃度越高促進作用越強(圖2)(P<0.01)。與0 μmol/L組相比，*P<0.05。

與0 μmol/L組相比，*P<0.05;

2.3 蒿甲醚抑制U251細胞p-Akt蛋白表達

不同濃度的蒿甲醚作用于U251細胞48 h后，應(yīng)用Western Blot方法檢測p-Akt蛋白的表達。如圖3所示，與0 μmol/L組相比, 200 μmol/L的Artemether未對p-Akt/Akt產(chǎn)生影響(P>0.05), 400 μmol/L和800 μmol/L的Artemether分別顯著降低p-Akt/Akt蛋白表達水平(P<0.05或P<0.01)。

3 討 論

本研究中，作者首先發(fā)現(xiàn)蒿甲醚以劑量依賴方式顯著抑制了U251人腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖活性，并明顯促進了U251細胞的凋亡。在進一步的研究中，作者發(fā)現(xiàn)蒿甲醚顯著抑制了U251細胞p-Akt的表達，提示蒿甲醚對膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用可能與抑制Akt信號通路有關(guān)。

與0 μmol/L組相比，*P<0.05;

膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，生物學特性是惡性度高, 增殖旺盛，極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[13]。膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)治療方法仍為手術(shù)切除, 但手術(shù)全切困難，極易復(fù)發(fā)，預(yù)后不佳[1]。因此輔助化療已經(jīng)成為膠質(zhì)瘤治療的標準輔助措施。青蒿素是1971年被中國科學家從中草藥中提取出的抗瘧疾藥物[14]。蒿甲醚是青蒿素最重要的甲基乙醚衍生物，被廣泛應(yīng)用于瘧疾，特別是抗藥性瘧疾的治療中[6，15]。近年來的研究[16]發(fā)現(xiàn)，蒿甲醚同時具有抑制周圍系統(tǒng)腫瘤增殖、血管新生的作用，并可誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡[9]。例如蒿甲醚對人肝癌細胞具有細胞毒性，還可通過引起DNA破壞而誘導(dǎo)人胃癌PG1100細胞的凋亡和壞死[10]。然而，蒿甲醚針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的作用及機制研究很少。有學者研究[11]發(fā)現(xiàn)蒿甲醚可以減少C6大鼠膠質(zhì)瘤細胞移植腫瘤的血管床密度和體積。體外研究[17]發(fā)現(xiàn)蒿甲醚能夠明顯抑制小鼠Nb2a膠質(zhì)母細胞和C6大鼠膠質(zhì)瘤細胞的增殖。在本研究中，作者首先利用濃度分別為0、50、100、200、400、600及800 μmol/L蒿甲醚作用于U251細胞，然后以MTT法觀察蒿甲醚對U251細胞增殖活力的影響。結(jié)果顯示0，200 μmol/L濃度未顯示出對膠質(zhì)瘤的抑制作用，而400 μmol/L以及更高濃度的蒿甲醚則顯著抑制其增殖活性，并且隨著濃度的增高抑制作用也在增強。該結(jié)果說明蒿甲醚以劑量依賴的方式抑制U251人膠質(zhì)瘤細胞的增殖。作者進一步的研究結(jié)果顯示，蒿甲醚還促進了膠質(zhì)瘤細胞凋亡。結(jié)合之前的研究，可以看出蒿甲醚具有成為膠質(zhì)瘤治療藥物的潛力。

蒿甲醚抑制膠質(zhì)瘤細胞的作用機制還不明確。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信號通路在多種重要的細胞生命活動，如細胞存活、增殖、趨化等過程中發(fā)揮作用[18]。PI3K/Akt信號通路與多種腫瘤的生物學行為密切相關(guān)，在卵巢癌，乳腺癌，子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤中，該信號通路被激活而抑制腫瘤細胞凋亡[19-22]。抑制PI3K/Akt信號通路可抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，并可促進其凋亡[23-25]。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)蒿甲醚顯著抑制了U251膠質(zhì)瘤細胞磷酸化Akt的表達水平。結(jié)合之前的研究，可以認為蒿甲醚是通過抑制膠質(zhì)瘤細胞Akt信號通路而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蒿甲醚能夠呈劑量依賴的方式抑制人U251膠質(zhì)瘤細胞的增殖活性、促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，同時發(fā)現(xiàn)該抑制作用可能系通過抑制膠質(zhì)瘤細胞的Akt信號通路而實現(xiàn)。本研究的結(jié)果為中草藥成分蒿甲醚進一步應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的治療提供了理論依據(jù)。

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