人結(jié)直腸黏膜層淋巴管微細(xì)分布及超微結(jié)構(gòu)

趙斌 陳福軍 于海濤 付巖 王錫山

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，淋巴道轉(zhuǎn)移是其廣泛播散的主要途徑。近年來，隨著癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)理研究的不斷深入，人體各部位器官內(nèi)淋巴管的分布規(guī)律和形態(tài)特征的研究已見一些文獻(xiàn)報道。本文應(yīng)用半薄切片、光鏡觀察及超薄切片電鏡觀察的方法研究了人結(jié)直腸黏膜層內(nèi)淋巴管的微細(xì)分布和超微結(jié)構(gòu)，以期為進(jìn)一步探討結(jié)直腸癌淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制提供必要的基礎(chǔ)材料。

材料與方法

一、一般資料

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科住院手術(shù)患者40例，均為單發(fā)、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移腫瘤。結(jié)腸標(biāo)本取材部位距腫瘤大于10 cm，直腸標(biāo)本為距腫瘤下緣大于3 cm。全層取材。標(biāo)本以中性福爾馬林及戊二醛固定。共40個蠟塊。

鼠抗人D2-40單克隆抗體、鼠抗CD34單克隆抗體、PV-6002二步法免疫組化檢測試劑盒、ZLI-9032濃縮型DAB試劑盒均購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

二、方法

中性福爾馬林固定標(biāo)本經(jīng)病理科脫水-透明-浸臘-包埋常規(guī)處理。共40個蠟塊標(biāo)本，每塊以10 um厚切片，連續(xù)切片切3張，一張經(jīng)HE染色，另二張采用免疫組化EnVision二步法染色。切片分別標(biāo)記D2-40及CD34，D2-40陽性而同部位CD34陰性者為淋巴管陽性。戊二醛固定標(biāo)本經(jīng)超薄切片，J EM2120 透射電鏡觀察。HE染色用來排除腫瘤侵潤。

常規(guī)脫蠟、水化組織切片。組織切片抗原修復(fù)——微波加熱。3%H2O2孵育10 min，PBS沖洗，2 min3次。加一抗，4度冰箱過夜。PBS沖洗2 min 3次，加PV-6002室溫孵育30 min，PBS沖洗2 min 3次。DAB顯色10 min，自來水沖洗，封片。

結(jié) 果

一、光鏡觀察結(jié)果

CD34與D2-40染色無交叉。圖1和圖2為CD34染色未見棕黃色，圖3和圖4為D2-40染色，于相同部位見棕黃淋巴管染色。

在光鏡下，結(jié)直腸壁分4層：即黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層，各層均含有淋巴管，黏膜層淋巴管，多位于黏膜固有層的深層。在黏膜肌內(nèi)也可見到毛細(xì)淋巴管，并向下深入至黏膜下層，可能是黏膜層毛細(xì)淋巴管與黏膜下層毛細(xì)淋巴管之間的吻合管(圖5)。固有層內(nèi)孤立淋巴小結(jié)周圍可見淋巴管(圖6)。黏膜層淋巴管管壁較薄，多為單層內(nèi)皮組成，形狀不規(guī)則，可呈現(xiàn)為擴(kuò)張、圓形、橢圓形、多角形或閉鎖的條索狀，有時管壁不完整。

圖1 J EM2120透射電鏡下CD34免疫組織化學(xué)染色圖像(10×10);圖2 J EM2120透射電鏡下CD34免疫組織化學(xué)染色圖像(10×40);圖3 J EM2120透射電鏡下D2-40免疫組織化學(xué)染色圖像(10×10);圖4 J EM2120透射電鏡下D2-40免疫組織化學(xué)染色圖像(10×40)

圖5 光鏡下結(jié)腸壁組織圖像，可見黏膜層毛細(xì)淋巴管與黏膜下層毛細(xì)淋巴管之間的吻合管(10x10);圖6 光鏡下結(jié)腸壁組織圖像，可見固有層內(nèi)淋巴管(10x10)

二、電子顯微鏡觀察結(jié)果

我們也發(fā)現(xiàn)黏膜層可見毛細(xì)淋巴管，位于黏膜固有層與黏膜肌層之間，官腔狹窄，僅由一層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，無孔窗，無周細(xì)胞，基膜不連續(xù)，可見鑲嵌連接，胞質(zhì)細(xì)胞器少。

三、CD34染色廣泛存在于黏膜固有層及黏膜肌層，管腔小，管壁薄，數(shù)量多。

討 論

迄今為止，有關(guān)淋巴管形成與腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的研究才剛剛起步，主要原因是缺乏淋巴管特異標(biāo)記物。常規(guī)組織學(xué)切片HE染色無法確切區(qū)分淋巴管及血管，近年來，隨著一系列淋巴管標(biāo)記物的相繼出現(xiàn)，使腫瘤淋巴管生成與腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系的研究逐漸成為繼腫瘤血管之后的新研究熱點(diǎn)[1]。

D2-40是腎小球足突細(xì)胞膜表面的跨膜粘蛋白，分子量為40 kDa，參與足細(xì)胞足突的形成和塑形。Geleff等[2]于1999年首次報道在淋巴系統(tǒng)中D2-40似乎僅在被覆單層內(nèi)皮細(xì)胞的小淋巴管，如終末淋巴管顯色，這些小淋巴管同時也表達(dá)VEGFR-3。它既不能使細(xì)胞或平滑肌的大淋巴管顯色，也不能使淋巴結(jié)內(nèi)的高內(nèi)皮靜脈顯色。超微結(jié)構(gòu)研究也表明D2-40主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的腔面，少部分表達(dá)于非腔面和細(xì)胞間質(zhì)。而在大淋巴管及血管內(nèi)皮中均不表達(dá)。其特異性明顯高于目前常用的淋巴管標(biāo)記物VEGFR-3、VEGF-C等。本研究發(fā)現(xiàn)D2-40標(biāo)記的淋巴管染色清晰，提示D2-40是研究腫瘤微淋巴管特異性相對較高的標(biāo)記物。

通過淋巴管和血管轉(zhuǎn)移是胃腸道惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑，惡性腫瘤細(xì)胞通過淋巴管和血管可以轉(zhuǎn)移到原發(fā)腫瘤以外的器官，大量臨床研究表明LVD與胃癌和結(jié)直腸癌的預(yù)后顯著相關(guān)[3，4];除此之外，惡性腫瘤細(xì)胞還借助血管提供其生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，并借助血管和淋巴管的引流維持組織的滲透壓[5]。因此，研究淋巴管和血管分布和生成特點(diǎn)有助于我們加深了解腫瘤的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。

當(dāng)腫瘤細(xì)胞局限于黏膜內(nèi)時，腫瘤細(xì)胞對氧氣和養(yǎng)分的需求增加較小，正常的血管供應(yīng)可以滿足腫瘤細(xì)胞生長的需要。但腫瘤細(xì)胞的代謝較為旺盛，導(dǎo)致腫瘤組織的滲透壓在該階段增加較快。因此，需要更多的淋巴管引流組織液以維持組織滲透壓。

長期以來，絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為正常大腸黏膜層內(nèi)不存在微淋巴管，所以大腸腺瘤即使癌變，如未突破基底膜，也不會發(fā)生轉(zhuǎn)移。故WHO2000年分類建議放棄使用“原位癌”的概念，而改用“高級別上皮內(nèi)瘤變”。這樣命名的主要目的是防治過度治療。然而我們的研究發(fā)現(xiàn)，在正常大腸黏膜層內(nèi)也有微淋巴管，且位于黏膜肌層兩側(cè)，在黏膜肌內(nèi)，也可見到毛細(xì)淋巴管，并向下深入至黏膜下層，與黏膜下層毛細(xì)淋巴管之間吻合，這與部分報道結(jié)直腸固有層存在淋巴管[6]觀點(diǎn)不符，與既往經(jīng)典的組織學(xué)描述更不一致。WHO 2000年結(jié)直腸癌定義為腫瘤穿透黏膜肌層到達(dá)黏膜下層，沒有對侵及黏膜肌層作描述，認(rèn)為結(jié)直腸高級別上皮內(nèi)瘤變不發(fā)生轉(zhuǎn)移，然而，蔡宏等人的回顧性研究證實(shí)，結(jié)直腸癌浸潤至黏膜肌層時有發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能[7].這是否與黏膜層存在淋巴管有關(guān)。He等[8]研究了從骨髓獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞及既存的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，在腫瘤淋巴管新生中不同的促進(jìn)貢獻(xiàn)度。在腫瘤或VEGF-C誘導(dǎo)的新生淋巴管模型中，沒有發(fā)現(xiàn)作了遺傳標(biāo)記的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞有明顯的作用。在腫瘤周邊區(qū)域，淋巴管新生的程度與淋巴管密度有相關(guān)性，不過雖然存在淋巴管新生，在淋巴管網(wǎng)發(fā)育不全的VEGF-C(+/-)小鼠卻沒有發(fā)生腫瘤淋巴管轉(zhuǎn)移。研究顯示：在腫瘤淋巴管新生和腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移的過程中，新形成的淋巴管是從既存的淋巴管網(wǎng)通過發(fā)芽方式產(chǎn)生的，而來源于骨髓的內(nèi)皮祖細(xì)胞在其中只起很小或不起作用。Achen等[9]的研究結(jié)果顯示，腫瘤在缺氧情況下分泌VEGF-C，通過旁分泌方式到達(dá)局部淋巴管，與VEGFR-3結(jié)合，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞以出芽方式向腫瘤組織生長，新生淋巴管可到達(dá)腫瘤周圍甚至進(jìn)入瘤內(nèi)，增加腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)會。因此，黏膜層存在淋巴管可作為早期轉(zhuǎn)移的解剖學(xué)依據(jù)。

早期腫瘤轉(zhuǎn)移的因素很多，正常大腸黏膜層內(nèi)存在微淋巴管這一發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)意義仍有待于進(jìn)一步觀察。

[1] Krishnan J，Kirkin V，Steffen A，et al.Differential in vivo and vitroexpression of vascular endothelial growth factor(VEGF)-C and VEGF-D in tumors and its relationship to lymphatic metastasis in immunocompetent rats.Cancer Res，2003，63：713-722.

[2] Karpanen T，Egeblad M，Karkkainen MJ，et al.Vascular endothelial growth factor C promotes tumor lymphangiogenesis and intralymphatic tumor growth.Cancer Res，2001，61：1786-1790.

[3] Liang P，Hong JW，Ubukata H，et al.Increased density and diameter of lymphatic microvessels correlate with lymph node metastasis in early stage invasive colorectal carcinoma.Virchows Arch，2006，448：570-575.

[4] Matsumoto K，Nakayama Y，Inoue Y，et al.Lymphatic microvessel density is an independent prognostic factor in colorectal cancer.Dis Colon Rectum，2007，50：30-31.

[5] Schoppmann SF.Lymphangiogenesis，inflammation and metastasis.Auticancer Res，2005，25：4503-4511.

[6] World Health Organization classification of tumor.Pathoiogy and genetics of tumours of the digestivesystem.IARC，2000：105-118.

[7] 蔡宏，莫善兢，師英強(qiáng)，等.早期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和臨床研究.中國實(shí)用外科雜志，2005，25(5)：273-276.

[8] He Y，Rajantie I，Ilmonen M，et al.Preexisting lymphatic endothelium but not endothelial progenitor cells are essential for tumor lymphangiogenesis and lymphatic metastasis.Cancer Res，2004，64(11)：3737-3740.

[9] Achen MG，McColl BK，Stacker SA.Focus on lymphangiogenesis in tumor metastasis.Cancer Cell，2005，7(2)：121-127.