MTHFD1基因多態(tài)性與大腸癌遺傳易感性的研究

彭勇　崔建華　趙新華等

[摘要] 目的 探討MTHFD1基因多態(tài)性與大腸癌遺傳易感性的相關(guān)性。方法 對96例大腸癌患者及96例健康體檢者采取問卷調(diào)查表的形式，選用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）檢測的方法。 結(jié)果 大腸癌患者中MTHFD1基因多態(tài)性G1958A位點(diǎn)rs2236225等位基因的頻率與健康對照組比較有顯著性差異（P<0.05）；rs2236225基因型者大腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.6倍（OR=1.603，95%CI=0.331～2.534，P<0.05）。 結(jié)論 MTHFD1基因多態(tài)性密切相關(guān)于大腸癌的易感性，MTHFD1多態(tài)性G1958A位點(diǎn)rs2236225基因改變是大腸癌的主要發(fā)病原因。

[關(guān)鍵詞] 亞甲基四氫；葉酸脫氫酶；基因多態(tài)性；大腸癌；易感性

[中圖分類號] R735.34 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）23-0001-03

[Abstract] Objective To explore the correlation of MTHFD1 gene polymorphism with genetic susceptibility to colorectal cancer. Methods Ninety-six cases of colorectal cancer patients and 96 cases of healthy controls were investigated by questionnaire， the polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） detection method was applied. Results Compared with normal control group， MTHFD1 G1958A polymorphism rs2236225 locus allele frequencies of patients with colorectal cancer had significant difference（P <0.05）； rs2236225 genotype risk of colorectal cancer increased 1.6 times（OR=1.603， 95%CI=0.331～2.534， P<0.05）. Conclusion MTHFD1 gene polymorphism is closely related to the susceptibility of colorectal cancer， the main course of colorectal cancer is the rs2236225 gen changes in G1958A site of MTHFD1.

[Key words] Methylenetetrahydrofolate； Folic acid dehydrogenase； Gene polymorphism； Colorectal cancer； Susceptibility

大腸癌是較為常見的消化道腫瘤之一，近年來，隨著全球環(huán)境及人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，大腸癌在全球的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)流行病學(xué)研究顯示，全世界每年約有100萬新發(fā)病例，且約有50萬患者死于大腸癌。目前如何提高患者治療效果、延長患者生存時(shí)間是臨床和基礎(chǔ)研究亟待解決的問題[1]。

亞甲基四氫葉酸脫氫酶在葉酸一碳單位代謝的過程中起著非常關(guān)鍵的作用，可催化3個(gè)連續(xù)反應(yīng)，且已有文獻(xiàn)報(bào)道MTHFD1基因多態(tài)性可能和大腸癌的發(fā)生有顯著關(guān)系[2]。本組研究就我院96例大腸癌患者采用PCR-RFLP法檢測大腸癌及健康受試者血清學(xué)基因型變化，分析MTHFD1基因多態(tài)性和大腸癌遺傳易感性之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取本院2010年12月～2012年12月來自寧鄉(xiāng)縣本地192例調(diào)查者為研究對象（包括96例大腸癌患者以及96例同期健康體檢者）。其中大腸癌患者（觀察組）男54例，女42例，年齡46～76歲，平均（54.7±6.3）歲， AJCC/UICC大腸癌TNM分期情況：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者分別有15例、4例、76例、1例。健康對照組96例，其中，男55例，女41例，年齡46～77歲，平均（54.2±6.8）歲，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組在年齡、性別等方面無顯著性差異，具有可比性（P>0.05）。

1.2 試驗(yàn)材料

引物：由北京奧科、擎科、賽百勝生物技術(shù)有限責(zé)任公司在DNA自動合成儀上合成，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）純化。HotStar DNA聚合酶購自Qiagen公司；Ex-Tap、LA-Tap、dNTP、Buffer和DL2000 DNA marker購自TaKaRa公司；瓊脂糖購自Gibcol公司；核酸限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

MTHFD1G1958A正向引物 5-CCCACTTTGAA GCAGGATTG-3；MTHFD1G1958A反向引物 5-CATCCCAATTCCCCTGATG-3。

1.4 方法

所有參與實(shí)驗(yàn)的受試者于問卷調(diào)查完成的次日清晨空腹抽取5 mL外周全血，基因組DNA提取的方式采用鹽析法，提取后定量到10 ng/μL，本實(shí)驗(yàn)通過倫理委員會批準(zhǔn)且受試者均簽署了知情同意書。

1.4.1 鹽析法提取血液基因組DNA 取5 mL血樣置于含EDTA-Na2管內(nèi)，然后置于50 mL的有蓋離心管內(nèi)；然后加入5～8倍體積（約40 mL）冷蒸餾水，通過反復(fù)顛倒的方式將其混勻后置于冰中5 min，在4℃的溫度條件下以3750 rpm離心20 min；離心后將上清液緩慢倒出，加入濃度為0.1%的 Trition-x100（預(yù)冷處理后）至沉淀中，搖勻后重復(fù)上述操作；為完全打碎沉淀，可倒入2 mL的裂解液，再加入10%濃度為5%左右的 SDS 100 μL，混勻；將濃度10 mg/mL的蛋白酶K 40～50 μL加入其中直至濃度為200 μg/mL，混勻后在55℃的條件下放置3 h或者在37℃溫度下過夜消化；添加0.7 mL的6.0 M NaCl后劇烈震蕩20 s；然后以3750 rpm離心40 min，將上清倒至50 mL有蓋離心管內(nèi)；加入2倍體積的冷無水乙醇，反復(fù)顛倒混勻處理至絮狀DNA沉淀出現(xiàn)，將其中1.5 mL的DNA挑出置于EP管內(nèi)，用濃度為80%的冷乙醇洗滌兩遍后抽干；為溶解DNA向其中加入TE 200 μL；定量至5～10 ng/μL，在96孔PCR板中制成DNA板，然后存于-20℃冰箱以備用。

1.4.2 PCR-RFLP法分型 按照GenBank現(xiàn)有的基因序列注釋方法，編輯并注釋基因序列，核酸限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的選擇、引物的設(shè)計(jì)分別使用DNAMAN軟件和軟件Primer3.0進(jìn)行處理。PCR擴(kuò)增方式按表1進(jìn)行；酶切上述3～5 μL 的PCR產(chǎn)物，過夜。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分型；纖細(xì)記錄分型的結(jié)果并給予統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析；驗(yàn)證分型的準(zhǔn)確性可隨機(jī)選取其中15%的分型樣本進(jìn)行測序處理。

3 討論

大腸癌可對患者的生活質(zhì)量造成十分嚴(yán)重的影響，是一種十分常見的惡性腫瘤。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，在北美、歐洲各國，大腸癌的死亡率占全部癌癥死亡原因的第2位[3]。現(xiàn)有大量相關(guān)研究證明在大腸癌病情發(fā)展的過程中，許多基因及細(xì)胞因子發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[4]。

定位于14q24的MTHFD1 基因共編碼氨基酸935個(gè)，總共對應(yīng)三種具有不同活性的蛋白酶，分別為：5、10 亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5、10 次甲基四氫葉酸環(huán)式水解酶和10甲基四氫葉酸合成酶，這三種蛋白酶均可催化四氫葉酸一碳單位交換過程中的3個(gè)連續(xù)反應(yīng)。其中MTHFD1 基因的內(nèi)部存在多個(gè)基因的突變位點(diǎn)，以G1958A（rs2236225）最多，G1958A（rs2236225）位點(diǎn)的突變會導(dǎo)致密碼子653 所編碼谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔捎谶@一變異發(fā)生于10 甲基四氫葉酸合成酶的活性區(qū)域內(nèi)部，因此出現(xiàn)突變會影響葉酸同型半胱氨酸代謝，導(dǎo)致核酸合成障礙和DNA 的低甲基化作用，最終引發(fā)產(chǎn)生染色體畸變[5]。

本研究對本院96例大腸癌患者進(jìn)行研究，并以同期96例健康體檢者作為對照，應(yīng)用PCR-RFLP檢測法檢測大腸癌人群的外周血中亞甲基四氫葉酸脫氫酶1基因多態(tài)性情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組中58例含GG基因型，26例含GA基因型，12例含AA基因型；而對照組中60例含GG基因型，32例含GA基因型，4例含AA基因型，MTHFD1 基因rs2236225 位點(diǎn)等位基因頻率分布在大腸癌患者和健康受試者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；計(jì)算觀察組與對照組突變等位基因G相對于等位基因A（OR=1.603，95%CI=0.331～2.534，P<0.05），rs2236225基因型者大腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.6倍。

本研究結(jié)果顯示：大腸癌組MTHFD1基因rs2236225基因型分布頻率和等位基因頻顯著異于健康受試者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MTHFD1 基因rs2236225多態(tài)是導(dǎo)致大腸癌的易感性的主要因素，而G/A雜合子可以有效降低大腸癌的發(fā)病率，是大腸癌的重要保護(hù)因素。目前已有研究表明，可導(dǎo)致DNA的甲基化的唯一因素是T/T基因型患者葉酸攝入水平過低。但是，關(guān)于MTHFR基因多態(tài)導(dǎo)致大腸癌易感性降低的作用方式仍然有待于進(jìn)一步分析研究[6，7]。

綜上所述，MTHFD1基因多態(tài)性與大腸癌的易感性顯著相關(guān)，這可能為大腸癌分子治療提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Bijnsdorp IV，Kruyt FA，F(xiàn)ukushima M，et al. Molecular mechanism underlying the synergistic interaction between trifluorothymidine and the epidermal growth factor receptor inhibitor erlotinib in human colorectal cancer cell lines[J]. Cancer Sci，2010，101（2）：440-447.

[2] 張艷玲，苑曉燕，張沖，等. 胸苷酸合成酶基因及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與遼寧本溪人群結(jié)直腸癌易感性的關(guān)系研究[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志，2008，13（9）：769-773.

[3] 朱凡，王敏明，張勤英. 血漿同型半胱氨酸、血清葉酸及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與結(jié)、直腸癌發(fā)病關(guān)系的研究[J]. 東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（1）：88-92.

[4] 于兆亞，湯靜. hOGG1基因多態(tài)性與胃癌遺傳易感性的關(guān)系[J]. 中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，3（20）：27-29.

[5] 沈曉波，池圣亮. 抑癌基因PTEN在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（33）：53-54，57.

[6] 周麗娜，譚悅，徐燕，等. 結(jié)直腸癌易感性與CYP1A1基因多態(tài)性關(guān)系的Meta分析[J]. 腫瘤研究與臨床，2013，25（8）：535-538.

[7] 孫靜鋒，張冬，聞鑒非，等. XRCC1R399Q基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性的Meta分析[J]. 中國腫瘤外科雜志，2013，5（2）：95-98.

（收稿日期：2014-05-19）

1.4.2 PCR-RFLP法分型 按照GenBank現(xiàn)有的基因序列注釋方法，編輯并注釋基因序列，核酸限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的選擇、引物的設(shè)計(jì)分別使用DNAMAN軟件和軟件Primer3.0進(jìn)行處理。PCR擴(kuò)增方式按表1進(jìn)行；酶切上述3～5 μL 的PCR產(chǎn)物，過夜。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分型；纖細(xì)記錄分型的結(jié)果并給予統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析；驗(yàn)證分型的準(zhǔn)確性可隨機(jī)選取其中15%的分型樣本進(jìn)行測序處理。

3 討論

大腸癌可對患者的生活質(zhì)量造成十分嚴(yán)重的影響，是一種十分常見的惡性腫瘤。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，在北美、歐洲各國，大腸癌的死亡率占全部癌癥死亡原因的第2位[3]?，F(xiàn)有大量相關(guān)研究證明在大腸癌病情發(fā)展的過程中，許多基因及細(xì)胞因子發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[4]。

定位于14q24的MTHFD1 基因共編碼氨基酸935個(gè)，總共對應(yīng)三種具有不同活性的蛋白酶，分別為：5、10 亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5、10 次甲基四氫葉酸環(huán)式水解酶和10甲基四氫葉酸合成酶，這三種蛋白酶均可催化四氫葉酸一碳單位交換過程中的3個(gè)連續(xù)反應(yīng)。其中MTHFD1 基因的內(nèi)部存在多個(gè)基因的突變位點(diǎn)，以G1958A（rs2236225）最多，G1958A（rs2236225）位點(diǎn)的突變會導(dǎo)致密碼子653 所編碼谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?，由于這一變異發(fā)生于10 甲基四氫葉酸合成酶的活性區(qū)域內(nèi)部，因此出現(xiàn)突變會影響葉酸同型半胱氨酸代謝，導(dǎo)致核酸合成障礙和DNA 的低甲基化作用，最終引發(fā)產(chǎn)生染色體畸變[5]。

本研究對本院96例大腸癌患者進(jìn)行研究，并以同期96例健康體檢者作為對照，應(yīng)用PCR-RFLP檢測法檢測大腸癌人群的外周血中亞甲基四氫葉酸脫氫酶1基因多態(tài)性情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組中58例含GG基因型，26例含GA基因型，12例含AA基因型；而對照組中60例含GG基因型，32例含GA基因型，4例含AA基因型，MTHFD1 基因rs2236225 位點(diǎn)等位基因頻率分布在大腸癌患者和健康受試者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；計(jì)算觀察組與對照組突變等位基因G相對于等位基因A（OR=1.603，95%CI=0.331～2.534，P<0.05），rs2236225基因型者大腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.6倍。

本研究結(jié)果顯示：大腸癌組MTHFD1基因rs2236225基因型分布頻率和等位基因頻顯著異于健康受試者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MTHFD1 基因rs2236225多態(tài)是導(dǎo)致大腸癌的易感性的主要因素，而G/A雜合子可以有效降低大腸癌的發(fā)病率，是大腸癌的重要保護(hù)因素。目前已有研究表明，可導(dǎo)致DNA的甲基化的唯一因素是T/T基因型患者葉酸攝入水平過低。但是，關(guān)于MTHFR基因多態(tài)導(dǎo)致大腸癌易感性降低的作用方式仍然有待于進(jìn)一步分析研究[6，7]。

綜上所述，MTHFD1基因多態(tài)性與大腸癌的易感性顯著相關(guān)，這可能為大腸癌分子治療提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Bijnsdorp IV，Kruyt FA，F(xiàn)ukushima M，et al. Molecular mechanism underlying the synergistic interaction between trifluorothymidine and the epidermal growth factor receptor inhibitor erlotinib in human colorectal cancer cell lines[J]. Cancer Sci，2010，101（2）：440-447.

[2] 張艷玲，苑曉燕，張沖，等. 胸苷酸合成酶基因及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與遼寧本溪人群結(jié)直腸癌易感性的關(guān)系研究[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志，2008，13（9）：769-773.

[3] 朱凡，王敏明，張勤英. 血漿同型半胱氨酸、血清葉酸及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與結(jié)、直腸癌發(fā)病關(guān)系的研究[J]. 東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（1）：88-92.

[4] 于兆亞，湯靜. hOGG1基因多態(tài)性與胃癌遺傳易感性的關(guān)系[J]. 中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，3（20）：27-29.

[5] 沈曉波，池圣亮. 抑癌基因PTEN在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（33）：53-54，57.

[6] 周麗娜，譚悅，徐燕，等. 結(jié)直腸癌易感性與CYP1A1基因多態(tài)性關(guān)系的Meta分析[J]. 腫瘤研究與臨床，2013，25（8）：535-538.

[7] 孫靜鋒，張冬，聞鑒非，等. XRCC1R399Q基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性的Meta分析[J]. 中國腫瘤外科雜志，2013，5（2）：95-98.

（收稿日期：2014-05-19）

1.4.2 PCR-RFLP法分型 按照GenBank現(xiàn)有的基因序列注釋方法，編輯并注釋基因序列，核酸限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的選擇、引物的設(shè)計(jì)分別使用DNAMAN軟件和軟件Primer3.0進(jìn)行處理。PCR擴(kuò)增方式按表1進(jìn)行；酶切上述3～5 μL 的PCR產(chǎn)物，過夜。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分型；纖細(xì)記錄分型的結(jié)果并給予統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析；驗(yàn)證分型的準(zhǔn)確性可隨機(jī)選取其中15%的分型樣本進(jìn)行測序處理。

3 討論

大腸癌可對患者的生活質(zhì)量造成十分嚴(yán)重的影響，是一種十分常見的惡性腫瘤。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，在北美、歐洲各國，大腸癌的死亡率占全部癌癥死亡原因的第2位[3]?，F(xiàn)有大量相關(guān)研究證明在大腸癌病情發(fā)展的過程中，許多基因及細(xì)胞因子發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[4]。

定位于14q24的MTHFD1 基因共編碼氨基酸935個(gè)，總共對應(yīng)三種具有不同活性的蛋白酶，分別為：5、10 亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5、10 次甲基四氫葉酸環(huán)式水解酶和10甲基四氫葉酸合成酶，這三種蛋白酶均可催化四氫葉酸一碳單位交換過程中的3個(gè)連續(xù)反應(yīng)。其中MTHFD1 基因的內(nèi)部存在多個(gè)基因的突變位點(diǎn)，以G1958A（rs2236225）最多，G1958A（rs2236225）位點(diǎn)的突變會導(dǎo)致密碼子653 所編碼谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?，由于這一變異發(fā)生于10 甲基四氫葉酸合成酶的活性區(qū)域內(nèi)部，因此出現(xiàn)突變會影響葉酸同型半胱氨酸代謝，導(dǎo)致核酸合成障礙和DNA 的低甲基化作用，最終引發(fā)產(chǎn)生染色體畸變[5]。

本研究對本院96例大腸癌患者進(jìn)行研究，并以同期96例健康體檢者作為對照，應(yīng)用PCR-RFLP檢測法檢測大腸癌人群的外周血中亞甲基四氫葉酸脫氫酶1基因多態(tài)性情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組中58例含GG基因型，26例含GA基因型，12例含AA基因型；而對照組中60例含GG基因型，32例含GA基因型，4例含AA基因型，MTHFD1 基因rs2236225 位點(diǎn)等位基因頻率分布在大腸癌患者和健康受試者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；計(jì)算觀察組與對照組突變等位基因G相對于等位基因A（OR=1.603，95%CI=0.331～2.534，P<0.05），rs2236225基因型者大腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.6倍。

本研究結(jié)果顯示：大腸癌組MTHFD1基因rs2236225基因型分布頻率和等位基因頻顯著異于健康受試者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MTHFD1 基因rs2236225多態(tài)是導(dǎo)致大腸癌的易感性的主要因素，而G/A雜合子可以有效降低大腸癌的發(fā)病率，是大腸癌的重要保護(hù)因素。目前已有研究表明，可導(dǎo)致DNA的甲基化的唯一因素是T/T基因型患者葉酸攝入水平過低。但是，關(guān)于MTHFR基因多態(tài)導(dǎo)致大腸癌易感性降低的作用方式仍然有待于進(jìn)一步分析研究[6，7]。

綜上所述，MTHFD1基因多態(tài)性與大腸癌的易感性顯著相關(guān)，這可能為大腸癌分子治療提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Bijnsdorp IV，Kruyt FA，F(xiàn)ukushima M，et al. Molecular mechanism underlying the synergistic interaction between trifluorothymidine and the epidermal growth factor receptor inhibitor erlotinib in human colorectal cancer cell lines[J]. Cancer Sci，2010，101（2）：440-447.

[2] 張艷玲，苑曉燕，張沖，等. 胸苷酸合成酶基因及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與遼寧本溪人群結(jié)直腸癌易感性的關(guān)系研究[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志，2008，13（9）：769-773.

[3] 朱凡，王敏明，張勤英. 血漿同型半胱氨酸、血清葉酸及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與結(jié)、直腸癌發(fā)病關(guān)系的研究[J]. 東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（1）：88-92.

[4] 于兆亞，湯靜. hOGG1基因多態(tài)性與胃癌遺傳易感性的關(guān)系[J]. 中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，3（20）：27-29.

[5] 沈曉波，池圣亮. 抑癌基因PTEN在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（33）：53-54，57.

[6] 周麗娜，譚悅，徐燕，等. 結(jié)直腸癌易感性與CYP1A1基因多態(tài)性關(guān)系的Meta分析[J]. 腫瘤研究與臨床，2013，25（8）：535-538.

[7] 孫靜鋒，張冬，聞鑒非，等. XRCC1R399Q基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性的Meta分析[J]. 中國腫瘤外科雜志，2013，5（2）：95-98.

（收稿日期：2014-05-19）