QuEChERS/高效液相色譜法同時測定水產品中16種多環(huán)芳烴

萬譯文，黃向榮，陳湘藝，曾春芳

(1.農業(yè)部漁業(yè)產品質量監(jiān)督檢驗測試中心(長沙)，中國 長沙 410153；2.湖南省水產科學研究所，中國 長沙 410153)

QuEChERS/高效液相色譜法同時測定水產品中16種多環(huán)芳烴

萬譯文1，黃向榮2*，陳湘藝1，曾春芳2

(1.農業(yè)部漁業(yè)產品質量監(jiān)督檢驗測試中心(長沙)，中國 長沙 410153；2.湖南省水產科學研究所，中國 長沙 410153)

建立了水產品中有16種多環(huán)芳烴藥物殘留量同時測定的高效液相色譜分析方法．樣品經乙腈提取，C18與中性氧化鋁凈化后，采用熒光-紫外檢測器串聯的方法對多環(huán)芳烴進行檢測．實驗結果表明，16種多環(huán)芳烴分離效果好，檢出限(LOD)為0.5～5.0μg/kg，相對標準偏差為1.7%～9.2% (n=6)，加標回收率達到71.8%～98.8%．該方法具有比較高的重現性和選擇性，對于水產品中多環(huán)芳烴的殘留測定具有很好的應用價值．

QuEChERS；高效液相色譜法；多環(huán)芳烴；水產品

多環(huán)芳烴(PAHs)類化合物是一種惰性較強的碳氫化合物．PAHs具有疏水性、半揮發(fā)性及難降解等特點，容易在生物體內富集[1-3]．PAHs能夠抑制植物的生長，對人類有明顯的“三致”效應(致癌、致畸、致突變)，已成為世界范圍的研究熱點[4-5]．歐盟食品科學委員會與美國環(huán)保局(USEPA)在2002年將16種PAHs列為優(yōu)先控制污染物；我國環(huán)?？偩謱⑵渲械?種PAHs列入優(yōu)先控制污染物的黑名單中．

由于我國工業(yè)化及城市化的快速發(fā)展，燃煤、燃油被廣泛地應用，產生的污染物不斷排入水域中，對漁業(yè)養(yǎng)殖帶來很大的危害，并影響到我國人民的身體健康和水產品的出口．隨著PAHs的環(huán)境污染越來越嚴重，環(huán)境中PAHs的相關研究也越來越多，目前PAHs的檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜法聯用等[6-8]，但大部分是基于環(huán)境方面的研究，例如水質、土壤以及沉積物等[9-11]．對于水產品的檢測技術目前研究得較少，鐘惠英等[12]利用氣相色譜-質譜法測定水產品中16種多環(huán)芳烴；方杰等[13]利用氣相色譜-離子阱質譜法測定貝類中的16種多環(huán)芳烴；孫秀梅等[14]采用高效液相色譜-熒光法測定水產品中15種多環(huán)芳烴．

由于水產品成分比較復雜，基質中含有大量的脂肪、蛋白質、碳水化合物以及色素等雜質，而多環(huán)芳烴作為親脂性化合物分布在樣品的脂質部分，同大分子物質緊密結合，因此，目前水產品中PAHs的提取過程中均采用皂化來去除脂類物質的干擾[12-14]．而皂化過程不僅耗時長且需要大量的化學試劑，前處理比較麻煩．QuEChERS方法是一種快速、簡單、經濟、高效、抗干擾、安全的樣品前處理方法，其原理是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質達到除雜凈化的目的[15-17]．本文通過采用QuEChERS技術進行樣品處理，通過對試驗條件的篩選和試驗方法的改進，利用高效液相色譜-熒光紫外聯用來同時測定水產品中的16種多環(huán)芳烴，縮短了前處理時間，靈敏度高，能實現對多環(huán)芳烴的快速檢測，滿足水產品質檢以及相關基礎研究的要求．

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，配備2489紫外可見光檢測器和2475多波長熒光檢測器；Waters LC-PAH柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；高速冷凍離心機(日本日立公司)；氮氣吹掃儀(美國Organomation公司)；固相萃取裝置(美國Agilent公司)；超聲波清洗器(昆山超聲波儀器廠)；精密電子天平(梅特勒—托利多稱重設備系統(tǒng)有限公司)；微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)．

16種多環(huán)芳烴混合標液：萘、苊、菲、蒽、芴、芘、崫、熒蒽、苊烯、苯并[α]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[α]芘、二苯并[α,h]蒽、苯并[g,h,i]苯和茚并[1,2,3-cd]芘，濃度為200 mg/L(美國Accustandard公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；C18吸附劑(0.063～0.212 mm,即70～230目，上海安譜科學儀器有限公司)；無水硫酸鎂(分析純，Adamas試劑公司)；無水乙酸鈉(分析純，Alfa Aesar天津化學有限公司)．

1.2 樣品前處理

稱取2 g樣品至于50 mL離心管中(精確至0.01 g)，加入5 mL超純水及15 mL乙腈，在漩渦混合儀上充分混合2 min，接著加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水乙酸鈉，放入超聲波清洗器中超聲提取10 min后，放入離心機8 000 r/min離心10 min，待分層后移取上清液8 mL至新的50 mL離心管中，待凈化．將0.5 g無水硫酸鎂、0.5 g C18吸附劑及0.2 g 中性氧化鋁加入裝有8 mL提取液的離心管中，混勻1 min，6 000 r/min離心5 min，準確移取5 mL上清液至10 mL離心管中，于45 ℃氮氣吹干后，加入1.0 mL乙腈溶解，過0.22 μm濾膜后，待測．

1.3 色譜條件

色譜柱為Waters LC-PAH柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；進樣量為20 μL；流動相A為乙腈，B為超純水；洗脫梯度為0～11 min，60%A；11～20 min,60%A～90%A；20～32 min，90%A；流速為1.2 mL/min．

2475多波長熒光檢測器，采用程序定時控制熒光檢測波長變化，測定除苊烯以外的15種多環(huán)芳烴，見表1． 2489紫外可見光檢測器，檢測波長229 nm(測苊烯)，與熒光檢測器串聯．

表1 PAHs的熒光檢測程序

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

歐盟規(guī)定將16種多環(huán)芳烴采用Waters 2695熒光檢測器檢測，但是由于苊烯的熒光響應值低，而在紫外檢測器中響應值較高，因此本文采用熒光和紫外串聯的方法對16種多環(huán)芳烴進行檢測，熒光檢測器根據各種化合物保留時間、最大吸收和最大發(fā)射波長來設置相應的檢測條件，紫外檢測器在229 nm處測苊烯．

由于普通的C18柱對PAHs中的菲和蒽、苯并[b]熒蒽和苯并[k]熒蒽的分離效果不好，本文采用Waters的PAH專用柱，同時對流動相、柱溫以及流速等因素進行了優(yōu)化，因此在本文所選色譜條件(1.3)下16種多環(huán)芳烴均能得到較好的分離，色譜圖見圖1．

A.熒光檢測色譜圖；B.紫外檢測色譜圖1.萘; 2.苊烯; 3.苊; 4.芴; 5.菲; 6.蒽; 7.熒蒽; 8.芘; 9.苯并[α]蒽; 10.崫; 11.苯并[b]熒蒽;12.苯并[k]熒蒽; 13.苯并[α]芘; 14.二苯并[α,h]蒽; 15.苯并[g,h,i]苝; 16.茚并[1,2,3-cd]芘

2.2 提取溶劑的選擇

水產品常用的提取溶劑有乙腈、甲醇和乙酸乙酯等，而采用QuEChERS方法是采用單一溶劑乙腈提取分離．本文比較了乙腈、甲醇和乙酸乙酯在提取PAHs上的不同，發(fā)現乙腈和甲醇均能較好的沉淀蛋白質，乙腈與蛋白質形成致密沉淀，甲醇與蛋白質形成絮狀沉淀，通過離心后，乙腈與蛋白質所形成的致密沉淀更容易去除，蛋白質含量低有利于下一步的QuEChERS凈化；而采用乙酸乙酯提取時，對魚肉中的雜質提取液較多，在氮吹濃縮過程中會殘留很多雜質吹不干，影響目標物的回收率．因此本文選擇乙腈作為PAHs的提取溶劑．

在提取過程中，比較了直接加乙腈和先加水再加乙腈2種不同的提取方式，結果表明，先加水再加乙腈提取能獲得更高的回收率，原因可能是先加水將樣品混勻后，加大樣品的分散程度，使樣品與提取溶劑能更充分的接觸，而且乙腈能與水互溶，可加大乙腈的滲透性，使提取效果最佳，PAHs各種目標物的回收率更高.

2.3 提取方式的選擇

在前處理過程中常用的提取方式有索氏提取、振蕩提取、超聲波提取及超臨界流體萃取法等．采用傳統(tǒng)的索氏法提取水產品中的PAHs，回收率滿足要求，但是提取時間過長，消耗溶劑較多，實驗效率不高[18]．美國環(huán)保局(EPA)推薦采用超聲波提取食品中的多環(huán)芳烴，具有簡單快捷，回收率高等特點[19]．傳統(tǒng)的QuEChERS方法采用將樣品勻漿后加入提取試劑充分的振蕩進行提取，本文采用將提取試劑加入樣品中混勻后，結合超聲波提取，使樣品與提取試劑充分的接觸，保證提取完全．實驗表明，采取振蕩與超聲混合提取后，目標物的回收率均在85%以上，且與傳統(tǒng)的索氏提取耗時10～24 h相比，本實驗的提取方式只需要12 min即可完成．

2.4 凈化方式的選擇

QuEChERS方法采用的是分散型固相萃取進行凈化，常用的吸附劑有PSA(乙二胺-N-丙基硅烷)、C18、中性氧化鋁、弗羅里硅土及石墨化炭黑(GCB)．GCB常用于去除提取液中的類甾體、葉綠素等色素；PSA含有伯胺和仲胺基團，可通過離子交換去除食品中的色素、糖類和有機酸等[20]；C18和中性氧化鋁也是一種常用的吸附劑，常用于非極性至中等極性物質的吸附，具有良好的除脂能力．吸附劑的選擇和用量根據不同的樣品基質來決定，對于水產品來說，由于魚肉中含有豐富的蛋白質及脂肪，本文選取PSA、C18及中性氧化鋁作為吸附劑進行優(yōu)化．將同一濃度的PAHs混合標準溶液中分別加入0.2 g以上3種吸附劑充分混勻后，過0.22 μm濾膜進入液相分析，發(fā)現經C18吸附后目標物的回收率要高于PSA，且C18成本低于PSA，可對吸附劑的組合進一步優(yōu)化．考慮到樣品提取液中殘留著水分和脂肪，本文考察了0.2～1.0 g無水硫酸鎂、0.5～1.0 g C18以及0.2～1.0 g中性氧化鋁不同比例組合的凈化效果．結果表明：當采用0.5 g無水硫酸鎂、0.5 g C18吸附劑及0.2 g 中性氧化鋁作為分散型固相萃取吸附劑時，溶液清亮，基質干擾小，目標物回收率高．

2.5 線性范圍與靈敏度

配置0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 mg/L的系列標準工作溶液，以待測物的濃度X(mg/L) 為橫坐標，待測物的峰面積Y為縱坐標制作標準曲線，得到PAHs的回歸方程和相關系數(見表2)．由表2可知，PAHs在0.005～0.5 mg/L范圍內其標準曲線的線性關系良好，可滿足定量分析的要求．在方法規(guī)定的取樣質量條件下，在陰性樣品中添加PAHs混合標準溶液，以3倍信噪比(S/N=3)得到檢出限．

表2 16種PAHs的線性范圍和靈敏度

2.6 回收率與精密度

為了確保分析數據的準確性、精密性和可比性，在空白樣品中添加10、50、100 mg/g 3個水平的添加實驗，每個添加水平進行3次實驗，每次平行測定6次，按1.2節(jié)所述條件進行加標回收率實驗，所得結果為回收率為71.8%～98.8%，相對標準偏差為1.7%～9.2%．方法學考察詳細結果見表3．

表3 PAHs在空白樣品中的添加回收率和相對標準偏差(RSDs，n=6)

2.7 實際樣品測定

運用本文建立的方法對市場中的對蝦樣品進行了分析檢測．結果表明：市場上有部分樣品存在PAHs污染，其中低環(huán)與中環(huán)的PAHs檢出率較高，其中芘含量最高，達到22.4 ng/g(見表4)．本方法適用于實際樣品的測定，可為PAHs在水產品中的消除規(guī)律及毒理評價提供靈敏、準確的分析手段．

表4 水產品中PAHs的含量(n=3)

ND: No detected.

3 結論

本文建立了QuEChERS/高效液相色譜法測定水產品中PAHs含量的檢測方法．通過對前處理條件及色譜條件的優(yōu)化，PAHs在0.005～0.5 mg/L范圍內其標準曲線的線性關系良好，檢出限LOD在0.5～5.0 mg/g之間；在不同的添加水平下，PAHs各組分的平均回收率在為71.8%～98.8%，相對標準偏差為1.7%～9.2%，符合國內外有關標準和法規(guī)的要求．該方法并可為PAHs在水產品中的消除規(guī)律及毒理評價提供靈敏、準確的分析手段，對水產食品的安全工作提供了有力的保障．

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(編輯 楊春明)

Simultaneous Determination of 16 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Aquatic Products by QuEChERS/HPLC

WANYi-wen1，HUANGXiang-rong2*,CHENXiang-yi1,ZENGChun-fang2

(1.Fishery Products Quality Supervision and Testing Center, Ministry of Agriculture, Changsha 410153, China；2.Hunan Fisheries Science Institute，Changsha 410153, China)

An analytical method for the determination of 16 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in aquatic products by high performance liquid chromatography was established. The sample was extracted with acetonitril, and the extract was cleaned up with C18and Alumina-N, detected with fluorescence and ultraviolet detector for PAHs. The results showed that the 16 PAHs can be separated efficiently. The detection limits of this method were 0.5～5.0 μg/kg. The relative standard deviations were ranging from 1.7%～9.2%, and the recovery rates were from 71.8%～98.8%. The method proposed by this paper possesses higher producibility and selectivity, and has promising applications in determining the PAHs in aquatic products.

QuEChERS; high performance liquid chromatography; polycyclic aromatic hydrocarbons; aquatic products

2013-09-04

國家水產品質量安全監(jiān)測資助項目(2011C028)；湖南省養(yǎng)殖業(yè)科研項目(201115)

*

,E-mailhns-11@126.com

TS254.7

A

1000-2537(2014)01-0042-06