結(jié)腸癌組織中SLP-2蛋白的表達及SLP-2基因?qū)CT-116細胞侵襲、遷移力的影響

張 劍，吳 敏，張自森，王利娟，張紅巧，師廣勇，巴 楠，閆 琳，鄭曉珂，邢 鑫

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

結(jié)腸癌組織中SLP-2蛋白的表達及SLP-2基因?qū)CT-116細胞侵襲、遷移力的影響

張 劍△，吳 敏，張自森，王利娟，張紅巧，師廣勇，巴 楠，閆 琳，鄭曉珂，邢 鑫

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

△女，1977年6月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤，E-mail:bluemoon630@163.com

結(jié)腸癌；SLP-2；siRNA；HCT-116細胞

結(jié)腸癌是常見的消化系惡性腫瘤, 其在歐美國家發(fā)病率較高, 在發(fā)展中國家發(fā)病率較低, 但近30 a來, 隨著生活水平及飲食習(xí)慣的改變, 我國結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率明顯升高。SLP-2基因?qū)儆趕tomatin基因家族成員，是最近發(fā)現(xiàn)的一個新基因[1]。近年來的研究[2-6]顯示，SLP-2在多種惡性腫瘤組織中過表達,可能是一個新的腫瘤相關(guān)基因。該研究采用免疫組化法檢測SLP-2蛋白在人結(jié)腸癌組織中的表達情況，并通過小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)下調(diào)結(jié)腸癌細胞HCT-116中SLP-2的表達，檢測轉(zhuǎn)染后HCT-116細胞中SLP-2的表達情況及細胞侵襲、遷移力的變化，旨在探討結(jié)腸癌組織中SLP-2的表達特點及SLP-2對結(jié)腸癌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1結(jié)腸癌組織中SLP-2蛋白的表達

1.1.1 病例來源 結(jié)腸癌組織及距離癌組織邊緣>5 cm的癌旁正常結(jié)腸組織為鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院2010年1月至2011年1月手術(shù)切除結(jié)腸癌標(biāo)本，共50例患者，其中男27例，女23例；年齡40～72歲，中位年齡63歲，≤50歲21例，>50歲29例；腫瘤直徑≤5 cm 32例，>5 cm 18例；高-中分化35例，低分化15例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期13例，Ⅲ+Ⅳ期37例。所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)腸癌，術(shù)前未接受過放、化療。

1.1.2 結(jié)腸癌組織中SLP-2蛋白表達的測定 鼠抗人SLP-2單克隆抗體稀釋度為1:200，購自美國Proteintech公司。免疫組化試劑盒購自邁新公司。用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。操作步驟按試劑盒說明書進行。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻[7],由2位高年資病理科醫(yī)師在雙盲條件下進行評分，每張切片選取5個100倍視野進行觀察，根據(jù)陽性細胞百分比及陽性細胞染色程度進行評分。細胞染色評分：無著色，0分；淺黃色，1分；黃色，2分；棕黃色，3分。陽性細胞百分比評分：無陽性細胞，0分；陽性細胞百分比<25%，1分；25%～，2分；50%～，3分；75%～，4分。2項評分相乘為總分，≥8分為高表達，<8分為陰性或低表達。

1.2SLP-2siRNA轉(zhuǎn)染后HCT-116細胞中SLP-2mRNA及蛋白的表達

1.2.1 細胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細胞系HCT-116購自上海中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。用含青霉素、鏈霉素和體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d傳代1次。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 SLP-2 siRNA序列：上游5’-UGCUGCCUGAUUUAUCUGUUCAGCC-3’，下游5’-GGCUGAACAGAUAAAUCAGGCAGCA-3’，由上海吉瑪公司設(shè)計合成。細胞按5×104孔-1接種于24孔板上。參考LipofectamineTM2000 說明書, 50 μL的RPMI 1640無血清培養(yǎng)液中加入20 pmol SLP-2 siRNA混勻,混勻Lipofectamin試劑，用50 μL無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋1 μL Lipofectamin試劑，混勻。將稀釋好的SLP-2 siRNA和Lipofectamin試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20 min，以形成siRNA/Lipofectamin復(fù)合物。將以上混合液加到含有細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，在體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃溫育24 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實驗設(shè)陰性對照組和空白對照組。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 RT-PCR及Western blot檢測 于轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，進行RT-PCR及Western blot檢測。①SLP-2擴增片段長度500 bp，上游引物5’-CTG GAGCCTGGTTTGAACAT-3’，下游引物5’-AGGATCT GGGCCTGTTTCTT-3’；內(nèi)參β-actin擴增片段長度242 bp,上游引物5’-ACACTGTGCCCATCTACGACC-3’，下游引物5’-AGGGGCCGGACTCGTCATAGA-3’。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，SLP-2及內(nèi)參上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀掃描電泳圖，以SLP-2與β-actin條帶灰度值的比值表示SLP-2 mRNA的相對表達量。②抗β-actin單克隆抗體及二抗均購自美國Santa Cruz公司。提取HCT-116細胞總蛋白，經(jīng)120 g/L SDS-PAGE電泳，穩(wěn)流冰浴電轉(zhuǎn)膜，分別與抗辣根過氧化物酶連接、孵育，DAB顯色。采用Image分析軟件分析條帶的灰度值。以SLP-2與β-actin條帶灰度值的比值表示SLP-2蛋白的相對表達量。

1.3SLP-2siRNA轉(zhuǎn)染對HCT-116細胞遷移力的影響用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染48 h后的各組HCT-116細胞，計數(shù)后用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋，調(diào)整細胞密度為1×107mL-1。在24孔Transwell小室(美國Costar公司)內(nèi)下層加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液500 μL，上室加入細胞懸液200 μL，置細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h。棄去上室液體，用棉簽拭去未穿過濾膜的細胞，經(jīng)固定液固定，結(jié)晶紫染色。選擇5個200倍視野，計數(shù)移至微孔膜下層的細胞數(shù)，取平均值表示細胞遷移能力。實驗重復(fù)3次。

1.4SLP-2siRNA轉(zhuǎn)染對HCT-116細胞侵襲力的影響在冰浴條件下取400 μL無血清培養(yǎng)液，加入50 μL Matrigel基質(zhì)(美國BD公司)，混勻后加入24孔Transwell小室的聚碳酯膜上各100 μL，Transwell小室置細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min以上，使Matrigel基質(zhì)成固態(tài)。細胞加入、固定、染色等步驟同1.3。選擇5個200倍視野，計數(shù)移至微孔膜下層的細胞數(shù)，取平均值表示細胞侵襲力。實驗重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析。結(jié)腸癌及配對正常組織中SLP-2蛋白表達的比較采用配對χ2檢驗，結(jié)腸癌組織中SLP-2蛋白的表達與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗進行分析，轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA后各組HCT-116細胞SLP-2 mRNA和蛋白的表達量以及細胞遷移、侵襲能力的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

圖1 正常結(jié)腸黏膜(A)及結(jié)腸癌(B)組織中SLP-2蛋白的表達(SP，×100)

表1 正常結(jié)腸黏膜及結(jié)腸癌組織中SLP-2蛋白的表達 例

2.2SLP-2蛋白表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表2。

2.3SLP-2siRNA轉(zhuǎn)染后HCT-116細胞中SLP-2mRNA及蛋白的表達結(jié)果見圖2、3和表3。

2.4轉(zhuǎn)染SLP-2siRNA后HCT-116細胞遷移、侵襲力的變化結(jié)果見圖4、表4。

表2SLP-2蛋白表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系例

臨床病理特征nSLP?2蛋白高表達陰性或低表達χ2P性別男271980．0040．951女23167年齡≤50歲211470．1920．662>50歲29218腫瘤直徑≤5cm3222100．0660．797>5cm18135分化程度高?中分化352411<0．001>0．999低分化15114淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有3431319．647<0．001無16412TNM分期Ⅰ+Ⅱ期134910．4740．001Ⅲ+Ⅳ期37316

圖2 轉(zhuǎn)染48 h后各組HCT-116細胞中SLP-2 mRNA的表達

圖3 轉(zhuǎn)染48 h后各組HCT-116細胞中SLP-2蛋白的表達

表3 轉(zhuǎn)染48 h后各組HCT-116細胞中SLP-2 mRNA及蛋白的表達(n=3)

*:與其他2組比較，P均<0.05。

圖4 SLP-2 siRNA對HCT-116細胞體外侵襲力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表4 3組SLP-2 siRNA對HCT-116細胞遷移能力和侵襲能力的影響(n=3)

*:與其他2組比較，P均<0.05。

3 討論

SLP-2基因是2000年首次發(fā)現(xiàn)并命名的一個新基因，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達，可能是一個新的惡性腫瘤相關(guān)基因。該研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中SLP-2呈高表達，而且其高表達與結(jié)腸癌TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示SLP-2可能參與結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。為進一步明確SLP-2對結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，設(shè)計合成SLP-2 siRNA，將其轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞HCT-116，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA后HCT-116細胞體外遷移和侵襲能力均較對照組減弱。由此推測，SLP-2基因可能促進結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上，該研究發(fā)現(xiàn)SLP-2蛋白在結(jié)腸癌組織中表達升高，并發(fā)現(xiàn)SLP-2可能參與促進結(jié)腸癌細胞的侵襲和遷移。該結(jié)果對尋找新的判斷結(jié)腸癌預(yù)后的指標(biāo)及發(fā)現(xiàn)新的結(jié)腸癌治療的分子靶點具有一定意義。

[1]Wang Y, Morrow JS. Identification and characterization of human SLP-2, a novel homo-logue of stomatin (band 7.2b) present in erythrocytes and other tissues[J]. J Biol Chem, 2000, 275(11):8062

[2]張劍,李建生,吳敏,等.SLP-2在胃癌組織中的表達及對胃腺癌細胞SGC7901運動侵襲的影響[J].中華消化雜志,2013,33(1):37

[3]Chang D,Ma K,Gong M,et al.SLP-2 overexpression is associated with tumour distant metastasis and poor prognosis in pulmonary squamous cell carcinoma[J].Biomarkers,2010,15(2):104

[4]Liu DN,Zhang L,Shen ZY,et al.Increased levels of SLP-2 correlate with poor prognosis in gastric cancer[J].Gastric Cancer,2013,16(4):498

[5]Cao WF,Zhang B,Li J,et al.SLP-2 overexpression could serve as a prognostic factor in node positive and HER2 negative breast cancer[J].Pathology,2011,43(7):713

[6]張劍,李建生,吳敏,等.胃腺癌組織中SLP-2的表達及其對SGC7901細胞增殖能力的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2013,48(1):73

[7]Wang YQ, Cao WF, Yu ZC, et al. Downregulation of a mitochondria associated protein SLP-2 inhibits tumor cell motility, proliferation and enhances cell sensitivity to chemo-therapeutic reagents[J]. Cancer Biol Ther, 2009, 8(17):1651

(2013-11-26收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Expression of SLP-2 protein in colorectal cancer tissue and its effects on migration and invasion of HCT-116 cells

ZHANGJian,WUMin,ZHANGZisen,WANGLijuan,ZHANGHongqiao,SHIGuangyong,BANan,YANLin,ZHENGXiaoke,XINGXin

DepartmentofOncology,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

coloretal cancer; SLP-2; siRNA; HCT-116 cell

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.019

R73-3