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    腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系*

    2014-08-31 09:04:06王鳳偉牛光明張鵬遠(yuǎn)陶勝忠
    關(guān)鍵詞:膠質(zhì)瘤腦組織引物

    王鳳偉,牛光明,張鵬遠(yuǎn),陶勝忠

    鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450014

    腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系*

    王鳳偉,牛光明,張鵬遠(yuǎn),陶勝忠#

    鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450014

    #通訊作者,男,1968年10月生,博士,主任醫(yī)師,研究方向:腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)與臨床,E-mail:tao2000zz@163.com

    膠質(zhì)瘤;Beclin-1;預(yù)后

    目的:探討人腦膠質(zhì)瘤組織中自噬相關(guān)基因Beclin-1的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。方法采用免疫組化SP法及RT-PCR技術(shù)檢測43例腦膠質(zhì)瘤組織(包括Ⅰ級5例,Ⅱ級17例,Ⅲ級12例,Ⅳ級9例)及11例非瘤腦組織中Beclin-1蛋白和mRNA的表達(dá),同時對隨訪資料進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。結(jié)果非瘤腦組織,Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=99.962和41.951,P均<0.001)。Ⅲ級、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA的表達(dá)水平低于Ⅰ級、Ⅱ級腦膠質(zhì)瘤組織和非瘤腦組織(P<0.05),Ⅰ級、Ⅱ級腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白的表達(dá)水平低于非瘤腦組織(P<0.05)。43例患者隨訪到35例,以腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白表達(dá)水平的中位數(shù)為界限,將35例患者分成Beclin-1蛋白低表達(dá)組(16例)及高表達(dá)組(19例),兩組的Kaplan-Meier生存曲線差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.962,P=0.026),Beclin-1蛋白高表達(dá)組預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)組。結(jié)論Beclin-1可作為判斷人腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的新指標(biāo)用于臨床。

    腦膠質(zhì)瘤是來源于神經(jīng)上皮的、顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,占顱內(nèi)腫瘤的40%~50%,該腫瘤多呈浸潤性生長,手術(shù)不易全切,治療效果差。近些年尋找新的腦膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)成為重要的研究方向。自噬相關(guān)基因Beclin-1是酵母ATG6基因在哺乳動物中的同源物,是第一個被確認(rèn)的自噬通路上的腫瘤抑制因子[1]。自噬通路中自噬相關(guān)基因的缺失在腫瘤發(fā)生及惡性演進(jìn)過程中起著重要作用。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[2-3]報道,自噬通路中Beclin-1基因的轉(zhuǎn)錄水平與腦膠質(zhì)瘤的增殖與惡性轉(zhuǎn)化關(guān)系密切。作者分析了不同病理級別腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1的表達(dá),并探討了其表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系,進(jìn)一步為腦膠質(zhì)瘤的靶向治療提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1標(biāo)本來源收集鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2009年7月至2011年8月手術(shù)切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本43例,標(biāo)本均經(jīng)病理確診,離體后0.5 h內(nèi)轉(zhuǎn)至-80 ℃深低溫冰箱凍存。患者均為初發(fā)病例,術(shù)前未接受放、化療等治療,其中男23例,女20例,年齡6~69(39.7±18.2)歲;星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤27例,少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤4例,室管膜細(xì)胞瘤5例,髓母細(xì)胞瘤4例,多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤2例,膠質(zhì)肉瘤1例;按照2007年WHO神經(jīng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級,其中Ⅰ級5例,Ⅱ級17例,Ⅲ級12例,Ⅳ級9例。另取11例來自同期收治的腦外傷或腦出血患者的非瘤腦組織標(biāo)本作為對照,患者男7例,女4例,年齡(31.4±13.8)歲。手術(shù)切除后標(biāo)本分成兩部分,一部分用于Beclin-1 mRNA的檢測,另一部分用于Beclin-1蛋白的檢測。

    1.2主要試劑Beclin-1一抗、兔抗羊免疫熒光IgG二抗均購于美國Santa Cruz公司,逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(TaKaRa公司)和RNA試劑盒(包括Taq酶)購于北京賽百盛基因技術(shù)有限公司,Beclin-1 PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    1.3非瘤腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白的檢測采用免疫組化SP二步法。冰凍組織常規(guī)制片,滴加用PBS稀釋100倍的Beclin-1一抗,然后滴加生物素化二抗工作液。染色嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。以已知陽性切片作為陽性對照,以PBS代替一抗作為陰性對照。Beclin-1蛋白陽性信號定位于細(xì)胞質(zhì)。利用Gel-Pro Analyzer 6.0圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析。每例切片在陽性反應(yīng)區(qū)域選擇5個200倍視野,計算染色區(qū)域累積光密度值與圖片去除空白處的面積之比,取5個視野的平均值表示Beclin-1蛋白的表達(dá)水平。

    1.4非瘤腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1mRNA的檢測根據(jù)GenBank提供的相關(guān)序列,應(yīng)用Primer 5.0軟件自行設(shè)計PCR引物,并通過NCBI/Primer-BLAST網(wǎng)進(jìn)行引物同源性比較。GAPDH引物序列:5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’(上游)和5’-GCCAGTAGAGGCAGGGAT-3’(下游),目的片段大小628 bp。Beclin-1引物序列:5’-GGCACAAT CAATAACTTCA-3’(上游)和5’-TGTCTCGCCTTTCT CAAC-3’ (下游),目的片段大小318 bp。取凍存標(biāo)本1 mm3,剪碎研磨,加入1 mL Trizol溶液裂解,按Trizol試劑盒說明書采用一步法提取總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。以cDNA為模板,進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件:94 ℃30 s,55 ℃35 s,72 ℃30 s,共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)成像,利用Gel-Pro Analyzer 6.0軟件進(jìn)行圖像分析,以目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶累積光密度值的比值表示Beclin-1 mRNA的表達(dá)水平。

    1.5預(yù)后分析采用門診隨訪或通訊聯(lián)系對43例患者進(jìn)行術(shù)后隨訪,截止時間為2013年11月??偵嫫诘挠嬎銖幕颊叩谝淮问中g(shù)時間開始到隨訪截止日期為止,或因其他疾病、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止,截尾值為0。

    1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。不同組織中Beclin-1蛋白和mRNA表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗;分別對Beclin-1蛋白陽性及陰性表達(dá)患者繪制Kaplan-Meier生存曲線,并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗;檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1非瘤腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA的表達(dá)見圖1、2和表1??梢钥闯觯X膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA的表達(dá)水平均低于非瘤腦組織。

    圖1 非瘤腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白的表達(dá)(SP,×200)

    圖2 非瘤腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1 mRNA的表達(dá)

    表1 非瘤和腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA表達(dá)水平的比較

    *:與非瘤腦組織比較,P<0.05;#:與腦膠質(zhì)瘤Ⅰ、Ⅱ級組織比較,P<0.05;△:與腦膠質(zhì)瘤Ⅲ級組織比較,P<0.05。

    2.2腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白的表達(dá)與患者術(shù)后生存情況的關(guān)系43例患者獲隨訪35例。根據(jù)腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白表達(dá)水平的中位數(shù)0.036為界限,將35例患者分成Beclin-1蛋白低表達(dá)組(16例)及高表達(dá)組(19例)。分別對Beclin-1蛋白高及低表達(dá)患者繪制Kaplan-Meier生存曲線,見圖3。經(jīng)log-rank檢驗,兩條生存曲線差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.962,P=0.026),Beclin-1高表達(dá)組患者預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)組。

    圖3 生存曲線

    3 討論

    Beclin-1是一個自噬相關(guān)基因,位于人染色體17q21,包括5’UTR 120 bp、1 353 bp的編碼區(qū)序列及3’UTR 625 bp序列。近年來自噬相關(guān)基因與腫瘤的研究引起了廣泛的關(guān)注,對于自噬相關(guān)基因在腫瘤中的表達(dá)及其在腫瘤演進(jìn)中的作用,以及在不同腫瘤或同一器官不同類別腫瘤,甚至同一腫瘤的不同發(fā)展階段的表達(dá),各研究結(jié)果報道不一致。相關(guān)研究報道食管鱗狀細(xì)胞癌[4]、胃癌[5]等腫瘤組織中Beclin-1的表達(dá)存在不同程度的降低,而肝癌[6]組織中卻呈現(xiàn)Beclin-1高表達(dá),而有關(guān)人腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1表達(dá)狀況的相關(guān)研究罕見報道。Aita等[7]認(rèn)為Beclin-1不僅參與自噬體的形成,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,還可通過調(diào)節(jié)自噬活性在腫瘤演變過程中發(fā)揮重要作用。Niu等[8]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用RNA干擾及基因敲除技術(shù)使人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN229、T98G和U251的Beclin-1基因沉默或表達(dá)缺失并沒有促進(jìn)細(xì)胞的增殖,反而誘導(dǎo)了細(xì)胞的自噬。馬明明等[9]的研究結(jié)果表明,用神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 Beclin-1的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞株自噬的同時,細(xì)胞增殖明顯受到抑制。上述相關(guān)研究提示,Beclin-1是一種具有雙重作用的自噬相關(guān)基因。

    黃新等[10]分析了62 例不同病理級別的星形細(xì)胞瘤組織中Beclin-1的表達(dá)情況,結(jié)果顯示星形細(xì)胞瘤組織中Beclin-1蛋白表達(dá)隨腫瘤病理級別的升高而降低,生存期大于36個月者Beclin-1表達(dá)水平高于生存期小于36個月者。該研究發(fā)現(xiàn),腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA表達(dá)水平均低于非瘤腦組織,并且隨膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化程度的降低(病理級別的升高)而逐漸下降,表明Beclin-1基因表達(dá)下調(diào)可能是腦細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的原因之一。同時,作者還發(fā)現(xiàn)Beclin-1蛋白高表達(dá)組預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)組,提示Beclin-1可作為腦膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷的輔助指標(biāo)用于臨床。

    總之,作者認(rèn)為,檢測腦膠質(zhì)瘤組織中Beclin-1的表達(dá)可能對腦膠質(zhì)瘤惡性程度及預(yù)后的判斷有一定的指導(dǎo)意義。

    [1]Yue Z,Jin S,Yang C,et al.Beclin 1, an autophagy gene essential for early embryonic development, is a haploinsufficient tumor suppressor[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(25):15077

    [2]Huang X,Bai HM,Chen L,et al.Reduced expression of LC3B-Ⅱ and Beclin 1 in glioblastoma multiforme indicates a down-regulated autophagic capacity that relates to the progression of astrocytic tumors[J].J Clin Neurosci,2010,17(12):1515

    [3]Cao Y,Klionsky DJ.Physiological functions of Atg6/Beclin 1: a unique autophagy-related protein[J].Cell Res,2007,17(10):839

    [4]單國用,劉興安,張松,等.食管鱗狀細(xì)胞癌組織中自噬基因Beclin 1蛋白的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2010,45(3):366

    [5]郭長青,邵經(jīng)浩,盧瑞利,等.胃癌組織中Beclin 1和PTEN蛋白的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2010,45(3):463

    [6]Tang H,Da L,Mao Y,et al.Hepatitis B virus X protein sensitizes cells to starvation-induced autophagy via up-regulation of beclin 1 expression[J].Hepatology,2009,49(1):60

    [7]Aita VM,Liang XH,Murty VV,et al.Cloning and genomic organization of beclin 1, a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21[J].Genomics,1999,59(1):59

    [8]Niu TK,Cheng Y,Ren X,et al.Interaction of Beclin 1 with survivin regulates sensitivity of human glioma cells to TRAIL-induced apoptosis[J].FEBS Lett,2010,584(16):3519

    [9]馬明明,王雪晶,丁雪冰,等.神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬性死亡[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床,2012,25(4):281

    [10]黃新,白紅民,陳亮,等.自噬相關(guān)基因Beclin 1在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義[J].中國微侵襲神經(jīng)外科雜志,2009,14(12):559

    (2013-11-07收稿 責(zé)任編輯王 曼)

    Expression of Beclin-1 in human glioma tissue and its relationship with the prognosis

    WANGFengwei,NIUGuangming,ZHANGPengyuan,TAOShengzhong

    DepartmentofNeurosurgery,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

    glioma;Beclin-1;prognosis

    Aim: To explore the relationship between the prognosis and the expression of autophagy-related gene Beclin-1 in human glioma tissue. Methods: Immunohistochemistry and RT-PCR technology were used to detect the expressions of Beclin-1 protein and mRNA in 43 cases of glioma tissue(including 5 cases of grade Ⅰ,17 cases of grade Ⅱ,12 cases of grade Ⅲ and 9 cases of grade Ⅳ)and 11 cases of non-tumor brain tissue. The follow-up data were analyzed by Kaplan-Meier survival analysis. Results: There were significant differences in the expressions of Beclin-1 protein and mRNA among non-tumor brain tissue, grade Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ glioma tissue(F=99.962 and 41.951,P<0.001).The expressions of Beclin-1 protein and mRNA in grade Ⅲ and grade Ⅳ glioma tissue were lower than those in grade Ⅰ,grade Ⅱglioma tissue and non-tumor brain tissue(P<0.05). The expression of Beclin-1 protein in grade Ⅰ and grade Ⅱglioma tissue was lower than that in non-tumor brain tissue(P<0.05).A total of 35 out of the 43 cases were followed up, 16 cases with low expression of Beclin-1 protein and 19 with high expression based on the median expression level.The Kaplan-Meier survival curves of the 2 groups differed from each other(χ2=4.962,P=0.026), and the prognosis of high expression of Beclin-1 protein group was better than that of the low expression group. Conclusion: Beclin-1 may be a new indicator to predict the prognosis of human glioma.

    10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.008

    *河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程資助項目 201004126

    R739.41

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