鐵甲草水煎液對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究*

★ 林柳青 李翎* 王金鳳 符運(yùn)舜

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)在讀研究生 廣東 廣州 510405)

鐵甲草(Cassia mimosoides Linn)為豆科(Leguminosae)決明屬植物，味甘、微苦，性涼，歸肝、腎和肺經(jīng)，具有清肝明目、利水通淋和解毒消癰等功效，多用于濕熱黃疸、頭昏眼花、水腫和癰腫疔瘡等的治療[1]。鐵甲草在廣東梅州地區(qū)民間主要用于慢性乙型肝炎和肝纖維化的治療，而其對急性肝損傷的保護(hù)作用鮮有報道。我們以昆明(KM)小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，對酒精和四氯化碳(CCl4)引起的急性肝損傷模型進(jìn)行了干預(yù)性治療，擬探討該藥物對急性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動物 SPF級KM小鼠，體重18g～22g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)(大學(xué)城)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK(粵)2008-0020；動物飼料購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)(大學(xué)城)實(shí)驗(yàn)動物中心；動物實(shí)驗(yàn)期間于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心SPF動物實(shí)驗(yàn)室(許可證號SYXK(粵)2008-0092)飼養(yǎng)和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑 鐵甲草水煎液：鐵甲草購自廣東梅州市蕉嶺縣，鐵甲草飲片加水煎煮，每次40分鐘，煎煮2次，合并煎液，過濾，濃縮至生藥濃度為2g/mL，冷藏保存，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水稀釋成濃度為1.2g/mL(鐵甲草高劑量)和0.6g/mL(鐵甲草低劑量)的鐵甲草水溶液。

聯(lián)苯雙酯混合液：聯(lián)苯雙酯，由廣州市齊云生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號kbt201212。使用時，先加入2%吐溫-80充分混合后，再加入蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍频?0mg/mL聯(lián)苯雙酯混合液。

50%乙醇溶液：無水乙醇(分析純)，由天津科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號：20120206，使用時用蒸餾水配制成50%乙醇溶液。

2% CCl4：CCl4(分析純)，由江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司生產(chǎn)，批號：20121012，使用時用花生油稀釋成0.2%四氯化碳溶液。

氯化鈉(NaCl)注射液：由四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：T100802。

測試試劑：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒，均來源于中生北控生物科技股份有限公司，ALT批號130401，AST批號130511。

1.3 儀器設(shè)備 離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠，型號LDL-5-A；電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司，型號YE20002；指標(biāo)測試儀器：OLYMPUS AU5421全自動生化分析儀。

2 方法

2.1 酒精急性肝損傷動物模型實(shí)驗(yàn)

2.1.1 動物與分組 KM小鼠50只，體重18～22g，隨機(jī)分成5組：正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組、鐵甲草高劑量組和鐵甲草低劑量組，每組10只，雌雄各半。

2.2.2 造模與給藥 各組先灌胃給藥，連續(xù)5天，每天1次。鐵甲草高、低劑量組分別按鐵甲草水煎液24g/kg、12g/kg給藥，聯(lián)苯雙酯組以聯(lián)苯雙酯混合液200mg/kg給藥，正常對照組和模型組給予等體積的生理鹽水，給藥期間正常進(jìn)食飲水。在給藥的第4天，除正常對照組外，其他各組動物制備急性酒精性肝損傷模型(50%乙醇灌胃1次，劑量為14mL/kg)，而正常對照組給予等體積生理鹽水，同時觀察小鼠的活動情況，第5天灌胃給藥后1h(造模后16h)摘眼球取血，離心，分離血清,測定血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST。

2.2 四氯化碳急性肝損傷動物模型實(shí)驗(yàn)

2.2.1 動物與分組 KM小鼠50只，體重18～22g，隨機(jī)分成5組：正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組、鐵甲草高劑量組和鐵甲草低劑量組，每組10只，雌雄各半。

2.2.2 造模及給藥 各組灌胃給藥，連續(xù)5天，每天1次。鐵甲草高、低劑量組分別按鐵甲草水煎液24g/kg、12g/kg給藥，聯(lián)苯雙酯組以聯(lián)苯雙酯混合液200mg/kg給藥，正常對照組和模型組等給予體積的生理鹽水，給藥期間正常進(jìn)食飲水。在最后一次灌胃給藥后除正常對照組外，其余各組動物按20mL/kg腹腔內(nèi)注射2% CCl4溶液，正常對照組則注射等體積的生理鹽水，觀察小鼠活動情況，在造模后16h摘眼球取血，離心，分離血清，測定血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST。

3 結(jié)果

3.1 酒精急性肝損傷動物模型實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見表1。正常組與模型組比較，AST、ALT均有顯著性差異(P<0.01)，說明造模成功；聯(lián)苯雙酯組、鐵甲草低劑量組、鐵甲草高劑量組與模型組比較，ALT、AST均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；鐵甲草低劑量組、鐵甲草高劑量組與聯(lián)苯雙酯組比較，ALT、AST均無顯著性差異(P>0.05)；鐵甲草低、高劑量組間比較，ALT、AST均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 鐵甲草對酒精急性肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響±s，n=10)

3.2 四氯化碳急性肝損傷動物模型實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見表2。正常組與模型組比較，AST、ALT均有顯著性差異(P<0.01)，說明造模成功；聯(lián)苯雙酯組、鐵甲草高劑量組與模型組比較，ALT、AST均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；鐵甲草低劑量組、鐵甲草高劑量組與聯(lián)苯雙酯組比較，ALT、AST均有顯著性差(P<0.01)；鐵甲草低、高劑量組間比較，ALT有顯著性差異(P<0.01)，AST無顯著性差異(P>0.05)。

表2 鐵甲草對急性四氯化碳肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響±s，n=10)

4 討論

肝損傷是各種肝臟疾病的常見病變結(jié)果，急性肝損傷在臨床上很常見，包括病毒、酒精、藥物、免疫等原因引起的急性肝炎，有很多中草藥對急性肝損傷有很好的療效。鐵甲草在廣東梅州地區(qū)民間主要用于慢性乙型肝炎和肝纖維化的治療，本文通過觀察血清轉(zhuǎn)氨酶的變化，探討鐵甲草對急性肝損傷的保護(hù)作用。

從鐵甲草對酒精急性肝損傷動物模型的干預(yù)實(shí)驗(yàn)可以看出，鐵甲草能有效的降低轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST，其降酶的效果與聯(lián)苯雙酯相當(dāng)，且高、低劑量的降酶效果相當(dāng)，說明鐵甲草對于酒精造成的急性肝損傷有很好的保護(hù)作用。酒精對肝損害的機(jī)制尚未完全闡明，可能是炎癥和免疫肝損傷動物模型研究進(jìn)展病理共同作用的結(jié)果，高濃度的酒精引起急性肝損傷產(chǎn)生大量毒性代謝產(chǎn)物和乙醛，并釋放腎上腺素引起肝臟血管收縮肝竇內(nèi)壓升高和肝細(xì)胞缺氧，導(dǎo)致空泡變性肝細(xì)胞溶解壞死[2]。在肝細(xì)胞中ALT主要存在于胞漿，AST主要存在于線粒體，從本實(shí)驗(yàn)看出，模型組ALT、AST顯著增高并且ALT增高的幅度比AST更大，表明酒精急性肝損傷動物模型所致的肝損傷以肝細(xì)胞膜的損傷為主。本實(shí)驗(yàn)中，鐵甲草對酒精引起的急性肝損傷保護(hù)作用的機(jī)制可能與其有保護(hù)肝細(xì)胞膜的作用有關(guān)。

在鐵甲草對四氯化碳急性肝損傷動物模型的干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)其降酶作用并不明顯，只有在高劑量時才有一定的療效，而且效果比聯(lián)苯雙酯差。CCl4導(dǎo)致肝損傷的主要機(jī)制目前認(rèn)為與其自身和自由基代謝產(chǎn)物有關(guān)。CCl4代謝產(chǎn)生的自由基進(jìn)入機(jī)體后，在肝臟經(jīng)細(xì)胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基和三氯甲基過氧自由，攻擊肝臟細(xì)胞膜上的磷脂分子，使得細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜發(fā)生氯烷化和脂質(zhì)過氧化，損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器；還能與膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子進(jìn)行共價結(jié)合，影響蛋白質(zhì)代謝，并且破壞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，鈣離子內(nèi)流增加，影響細(xì)胞正常生理功能，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞胞質(zhì)中的可溶性酶滲出，細(xì)胞死亡[3]?？梢娝穆然技毙愿螕p傷動物模型對肝臟造成的損傷比較復(fù)雜，既有細(xì)胞膜的損傷，也有細(xì)胞器的損傷，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可看出，模型組ALT、AST均有明顯增高且增高幅度相當(dāng)。在此實(shí)驗(yàn)中，鐵甲草對急性肝損的保護(hù)作用在高劑量時有效。而在高劑量時，ALT比模型組約降低28%，而AST只降低約13%，這表明鐵甲草對于降低ALT的效果比AST好，從而提示其對肝細(xì)胞膜的保護(hù)作用效好，而對細(xì)胞器的保護(hù)作用較差。

在臨床中，急性肝炎所致的肝損傷一般以肝細(xì)胞膜的損傷為主，特別是損傷的早期，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，轉(zhuǎn)氨酶升高。本研究發(fā)現(xiàn)鐵甲草對急性肝損傷有一定的保護(hù)作用，特別是對比較輕微的損傷的保護(hù)作用更明顯，有明顯的降酶效果，并且發(fā)現(xiàn)其機(jī)制為鐵甲草能夠有效地保護(hù)肝細(xì)胞膜，而對細(xì)胞器的保護(hù)作用較差。綜上所述，鐵甲草對急性肝炎，特別是急性肝炎的早期有一定的療效，有一定的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究其對肝細(xì)胞膜損傷保護(hù)作用的具體機(jī)制。

[1]宋立人,洪恂,丁緒亮,等.現(xiàn)代中藥大辭典[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:184.

[2]周寧,厲有明.大鼠酒精性肝纖維化模型的構(gòu)建[J].東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2003,22(2):93-97.

[3]Lesage G D, Benedetti A, Glaser S, et al. Acute carbon tetrachloride feeding selectively damages large, but not small, cholangiocytes from normal rat liver[J].Hepatology,1999,29(2):307-319.