丹參注射液超聲霧化前后三種成分的質(zhì)量分析*

★ 韓飛 肖雄* 夏夢欣 李瀚南 羅曉健

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330004；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程中心 江西 南昌 330006)

丹參注射液具有活血化淤、理氣開竅、養(yǎng)血安神、調(diào)經(jīng)止痛、涼血消癰之功效，同時(shí)還具有擴(kuò)張血管、增進(jìn)冠狀動(dòng)脈血流量的作用[1,2]。臨床上主要用于治療胸悶、心悸、心絞痛，急慢性心肌梗塞，缺血性腦中風(fēng)，腦梗塞或中風(fēng)后遺癥等病癥。

近年來，有大量文獻(xiàn)報(bào)道丹參注射液可采用超聲霧化吸入的方式治療毛細(xì)支氣管炎、急性肺炎、咽炎，甚至心絞痛等疾病，并取得了較好的療效[3-7]，但目前大多數(shù)報(bào)道只關(guān)注其霧化吸入的實(shí)際療效，而很少從制劑基礎(chǔ)研究的層面上去探討其霧化吸入的可行性，本文建立了同時(shí)測定丹參注射液超聲霧化液中原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮ⅡA的含量檢測方法，并對比超聲霧化前后三種成分含量的變化，初步研究了丹參注射液霧化吸入的可行性。

1 儀器與試劑

魚躍牌4021AI超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，蘇藥管械準(zhǔn)字2002第223)；EPED-20TH純水器(上海精密儀表有限公司)；KQ5200DA超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，感量0.01mg)；Agilent-1200高效液相色譜儀：Agilent-1200泵，VWD檢測器，Agilent-1200化學(xué)工作站。

原兒茶醛對照品，丹酚酸B對照品，丹參酮ⅡA對照品(均購自中國藥品生物制品檢定所，批號110810-201007，111562-201111，110766-201019)；丹參注射液(上海中西制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z31020345，規(guī)格2mL/支)；甲醇(色譜純，上海星可化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini 5u C18110A(250mm×4.6mm，5μm，美國菲羅門)；流動(dòng)相 甲醇(B)-0.1%磷酸水(A)按表1的程序梯度洗脫；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量5μL；柱溫30℃；檢測波長280nm；原兒茶醛的保留時(shí)間(tR)2.368min，丹酚酸B的保留時(shí)間(tR)3.471min，丹參酮ⅡA的保留時(shí)間(tR)11.582min。在上述色譜條件下，三種成分與相鄰成分有較好的分離，各成分的理論塔板數(shù)均大于5000，色譜圖見圖1。

表1 流動(dòng)相洗脫程序表

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮ⅡA對照品適量，色譜甲醇溶解，置10mL容量瓶中，稱重，超聲20min，放冷，甲醇補(bǔ)足失重，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得原兒茶醛(0.146mg/mL)、丹酚酸B(0.096mg/mL)、丹參酮ⅡA(0.343mg/mL)的混合對照品溶液。

2.2.2 丹參(甲醇)溶液的制備 精密量取4.0mL丹參注射液(批號：20140315)，色譜甲醇溶解，置50mL容量瓶中，稱重，超聲兩次，每次15min，放冷，甲醇補(bǔ)足失重，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得丹參(甲醇)溶液。

1.原兒茶醛；2.丹酚酸B；3.丹參酮ⅡA

2.2.3 丹參注射液超聲霧化液的收集 取干燥的錐形瓶一個(gè)，置于裝滿500mL水的燒杯中，冷凍12 h，取出，將同口徑的霧化導(dǎo)管接于錐形瓶上，密封膜纏封，經(jīng)檢查氣密性良好。大霧化杯中裝入約500mL超純水，小霧化杯中加入2.2.2項(xiàng)下制備的150mL溶液，蓋上頂蓋，頻率調(diào)至1.7MHz±10%；霧化量調(diào)至4mL/min；打開電源，霧化30min后，關(guān)閉電源，轉(zhuǎn)移至40℃恒溫水浴鍋中加熱，收集所得霧化液，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得丹參注射液超聲霧化液。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取原兒茶醛(0.146mg/mL)、丹酚酸B(0.096mg/mL)、丹參酮ⅡA(0.343mg/mL)對照品溶液，各0.1，1，2，4，6，8，10mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，定容，分別精密吸取溶液各10μL，注入色譜儀，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明在進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

表2 三種成分線性回歸方程

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下對照品溶液10μL，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果顯示原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮ⅡA峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.743%，1.430%，1.288%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.2.2和2.2.3項(xiàng)方法平行制成6份超聲霧化液(批號20140323)，在上述色譜條件下，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，結(jié)果顯示原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為1.257%，1.792%，1.318%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一超聲霧化液(批號20140323)10μL，分別于0，2，4，8，12，24 h，在上述色譜條件下，測定峰面積，結(jié)果顯示原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為1.191%，1.223%，1.607%，表明超聲霧化液樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取18份任意批號的丹參注射液，分成3組，每組6份，分別加入各對照品適量，按2.2.2和2.2.3項(xiàng)的方法制備成樣品溶液，精密吸取樣品溶液10μL，在上述色譜條件下，測定峰面積，各成分回收率在98.03%～101.66%，RSD<2%，結(jié)果見表3。

2.9 樣品測定 按2.2.1項(xiàng)方法制備成供試品五批，在按照2.3項(xiàng)方法制備成超聲霧化液，精密吸取10μL，在上述色譜條件下測定，按照外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表4。

2.10 超聲霧化前后三種成分含量變化 按照2.2.2和2.2.3項(xiàng)的方法，各制備一批樣品溶液，分別吸取上述兩種溶液各10μL，在上述色譜條件下測定，記錄色譜峰面積，測定各成分的含量等，見表5，圖2。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 不同樣品三種成分測定結(jié)果 /mg·mL-1

表5 霧化前后各成分含量變化 /mg·mL-1

C.霧化前色譜圖；D.霧化后色譜圖

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9-12]曾嘗試過乙腈-水(73∶27)，甲醇-0.5%磷酸溶液(4∶96)，甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)，甲醇-水-冰醋酸(21∶78∶1)等流動(dòng)相，結(jié)果分離效果均不好。最終確定采用甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脫(表1)，此流動(dòng)相可同時(shí)分離三種成分，且該方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，分離度高，所用時(shí)間僅為30min。

3.3 收集裝置的選擇 在現(xiàn)用裝置前曾嘗試連接冰冷凍過的冷凝管，但霧化后小液滴的溫度較低，且為液態(tài)，而非氣態(tài)，所以使用熱交換法使其冷凝的方式幾乎無效，故采用本實(shí)驗(yàn)裝置，使小液滴在相對封閉的環(huán)境中達(dá)一定壓力從而凝聚為大液滴而形成霧化收集液。另霧化管中亦有霧化液殘留，收集量可觀，約占最終收集液的90%。同時(shí)，霧化過程中，頂蓋出霧口有回流現(xiàn)象，故小霧化杯中存留的大量藥液有一部分也經(jīng)過了霧化過程，符合霧化吸入的條件。

3.4 超聲霧化參數(shù) 本實(shí)驗(yàn)所采用的超聲霧化參數(shù)(超聲頻率：1.7MHz±10%；霧化量：4mL/min；霧化時(shí)間：30min)，參考了相關(guān)文獻(xiàn)[5,7]，與臨床上采用的參數(shù)基本一致，具有一定的代表性，但霧化的方式不同，如采用氧驅(qū)動(dòng)霧化吸入，三種成分的含量是否變化還有待于進(jìn)一步研究[13,14]。

3.6 超聲霧化前后的變化 通過對比丹參注射液霧化前后三種成分的變化發(fā)現(xiàn)，其含量的改變極小，出峰數(shù)基本相同，由圖2，表5可知，霧化后出峰數(shù)甚至多出2個(gè)，出峰時(shí)間集中在2.5～5min。分析原因可能是經(jīng)過超聲霧化后，促進(jìn)了樣品中水溶性成分的溶解，使得原本在甲醇中溶解度不大的成分可在流動(dòng)相中洗脫，故產(chǎn)生了“多峰現(xiàn)象”，但總體來說，其峰面積小于7，含量幾乎可以忽略不計(jì)。此結(jié)果為探討丹參注射液霧化吸入給藥的可行性，提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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