毛鉤藤不同采收期總生物堿與多糖含量變化研究*

★ 唐才林 高言明 楊春 林昌虎 吳明花 徐東升

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院 貴州 貴陽 550002；2.貴州理工學(xué)院 貴州 貴陽 550003；3.貴州科學(xué)院 貴州 貴陽 550001)

中國藥典2010版上還未收載采用有效成分含量作為中藥鉤藤質(zhì)量評價的標(biāo)準(zhǔn)[1]，鉤藤藥材的采收期是根據(jù)民間習(xí)慣于秋、冬二季采收。鉤藤在臨床上主要用于降壓，其藥效成分主要為生物堿類，本實驗通過考察不同采收期毛鉤藤中總生物堿與多糖含量的變化情況來研究毛鉤藤的最佳采收期具有一定的現(xiàn)實意義。

1 儀器與試藥

紫外-可見分光光度計(島津UV-2501PC)；AE-240雙量程電子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。異鉤藤堿對照品(批號：111927-201102，中國食品藥品檢定研究院)；醋酸，醋酸鈉，溴甲酚綠，葡萄糖，氨水，三氯甲烷等均為分析純，水為蒸餾水。藥材樣品采自貴州省開陽縣翁昭村毛鉤藤種植基地人工種植五年生毛鉤藤，采樣于2012年1月～2012年12月，按每月1～10號之內(nèi)在同一毛鉤藤種植區(qū)域中采取帶鉤老莖枝作為樣品，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院付志明鑒定為茜草科植物毛鉤藤(UncariahirsuteHavil)，藥材樣品在室內(nèi)陰干經(jīng)粉碎后于45℃烘至恒重并置于干燥器中備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 毛鉤藤總生物堿含量分析[2]

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 對照品溶液和供試品溶液的制備 取異鉤藤堿對照品10.30mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為103.00μg/mL的對照品溶液。精密稱取鉤藤樣品粉末約0.16g，置于50mL具塞的錐形瓶中，加入1%鹽酸甲醇10mL，放入4℃冰箱中冷浸12h后取出，室溫超聲45min，濾過，再加入1%鹽酸甲醇10mL，室溫超聲45min，濾過，合并濾液于蒸發(fā)皿中，置60℃水浴中揮干濾液，殘渣加10mL稀氨水溶解，使溶液呈堿性，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加10mL氯仿，充分振搖萃取3min，靜置分層，收集氯仿層，反復(fù)萃取3次，將合并的氯仿層于蒸發(fā)皿中60℃水浴揮干，殘渣加pH=3.4的緩沖液和酸性染料各5mL，溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，精密加入10mL氯仿，充分振搖萃取3min，靜置分層，收集氯仿層，反復(fù)萃取3次，合并氯仿層溶液，即為顯色后的供試品溶液。

2.1.1.2 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的制備 配制0.2mol/L的醋酸鈉溶液250mL，0.2mol/L的醋酸溶液500mL，備用，使用之前按醋酸鈉溶液約0.88mL與醋酸溶液約24.12mL混勻，用pH計精密調(diào)至pH=3.4。

2.1.1.3 溴甲酚綠酸性染料溶液的制備 稱取溴甲酚綠0.25g，加0.05mol/L的氫氧化鈉溶液5mL研磨，再加水配成500mL，用三氯甲烷洗棄脂溶性雜質(zhì)至三氯甲烷層不顯色，儲存于500mL容量瓶中備用。

2.1.2 測定波長的選擇 分別用按2.1.1.1項制備并顯色后的供試品和對照品溶液，同法制備空白溶液，在紫外-可見分光光度計300～500nm波長范圍內(nèi)掃描，得最大吸收波長為410nm。

2.1.3 顯色條件的選擇

2.1.3.1 緩沖液pH值的選擇 由于在顯色體系中pH值對顯色效果影響最大，因此首先配制pH值分別為3.1，3.4，3.6，3.8，4.0，4.2，4.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。精密量取6份異鉤藤堿對照品溶液各5mL于蒸發(fā)皿中，60℃水浴上揮干溶劑后分別用以上緩沖溶液各5mL和5mL溴甲酚綠酸性染料溶解殘渣,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，再精密加入10mL氯仿，充分振搖萃取3min，靜置分層，收集氯仿層，反復(fù)萃取3次，合并氯仿層溶液，同法制備7個相應(yīng)pH值的空白溶液，于紫外-可見分光光度計410nm波長處測定吸光度，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示緩沖溶液pH為3.4時吸光度最大，故選擇之。

表1 緩沖溶液不同pH值試驗結(jié)果

2.1.3.2 溴甲酚綠溶液用量的選擇 精密吸取對照品溶液共5份，每份2mL，于蒸發(fā)皿中在60℃水浴鍋上緩慢蒸干，分別加入pH為3.4的緩沖溶液5mL和不同體積的溴甲酚綠酸性染料溶解殘渣，按2.1.3.1項“轉(zhuǎn)移至分液漏斗中”同法操作，并同法制備5個相應(yīng)溴甲酚綠酸性染料用量的空白溶液在410nm波長處測定吸光度。結(jié)果見表2，可知溴甲酚綠酸性染料用量為5mL時較為適宜。

表2 溴甲酚氯染料用量選擇試驗結(jié)果

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為103.00μg/mL的異鉤藤堿對照品2.0，4.0，5.0，7.0，9.0mL于5個10mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得一系列濃度梯度的對照品溶液。分別精密吸取上述各濃度的對照品溶液5mL于蒸發(fā)皿中60℃水浴上揮干，殘渣按2.1.1.1項下“殘渣加pH=3.4的緩沖液和酸性染料各5mL”起同法操作，以相應(yīng)試劑為空白，用紫外-可見分光光度計在410nm波長處測定吸光度，以對照品的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸計算，得總生物堿的回歸方程為：Y=0.053X+0.0422，r=0.9997。結(jié)果表明總生物堿在3.43～15.45μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取按上述方法制備的對照品溶液5mL，顯色后，分別測定6次吸光度，計算RSD為2.41%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取按“2.1.1.1”項下制備的供試品溶液，分別在0，0.5，1，1.5，2，2.5，3h進(jìn)行吸光度測定，計算RSD為1.38%，表明供試品溶液在3h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 精密稱取3月份采收的毛鉤藤樣品粉末6份，每份約0.16g，分別置于6個50mL具塞錐形瓶中，按“2.1.1.1”項下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計在410nm處測定吸光度，計算出該鉤藤藥材的總生物堿(以異鉤藤堿計)的平均含量為0.17%，RSD為1.81%。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知總生物堿平均含量為0.17%的毛鉤藤樣品粉末6份，每份約0.08g，分別置6個50mL具塞錐形瓶中，每份分別精密加入濃度為144.00μg/mL的異鉤藤堿對照品1mL，按“2.1.1.1”項下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計在410nm處測定吸光度，計算得平均回收率為100.78%，RSD%為2.81。

2.1.9 樣品含量測定 按2.1.1.1項下制備方法，對各毛鉤藤樣品進(jìn)行供試溶液制備，每份樣平行3份，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計在410nm處測定吸光度，計算出總生物堿(以異鉤藤堿計)的含量，結(jié)果見表1。

2.2 毛鉤藤多糖含量分析[3]

2.2.1 對照品溶液和供試品溶液的制備 取經(jīng)105℃干燥至恒重的無水葡萄糖0.0903g，精密稱定，置100mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為903.00μg/mL的對照品溶液。取毛鉤藤樣品粉末約0.4g，精密稱定，置于100mL圓底燒瓶中，加水50mL，稱定重量，靜置1h，加熱回流1h，取出，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，過濾。精密吸取續(xù)濾液10mL，置100mL的容量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取2mL，置具塞的比色管中，精密加入4%苯酚溶液1mL，混勻，迅速精密加入濃硫酸7mL，搖勻，置40℃水浴中保溫30min，取出，放冷至室溫，即得供試品溶液。

2.2.2 苯酚溶液的制備 稱取已重蒸餾過的苯酚10.00g，置于250mL的容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，得濃度為4%的苯酚溶液，備用。

2.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為903.00μg/mL的葡萄糖對照品溶液2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，8.0mL，分別置于6個100mL的容量瓶中，各加水稀釋至刻度，搖勻，得一系列濃度梯度的對照品溶液。分別精密吸取上述濃度的對照品溶液2mL，置具塞比色管中，各精密加入4%苯酚溶液1mL，混勻，迅速精密加入濃硫酸7mL，搖勻，置40℃水浴中保溫30min，取出，放冷至室溫，同法做試劑空白，用紫外-可見分光光度計在488nm波長處測定吸光度，以對照品的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸計算，得多糖的回歸方程為：Y=0.0545X+0.0015，r=0.9994。結(jié)果表明多糖在4.52～14.45μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取濃度為903.00μg/mL的對照品溶液5mL，置于100mL的量瓶中，加水稀釋至刻度，得濃度為45.15μg/mL的對照品溶液，精密吸取上述對照品溶液2mL，顯色后分別進(jìn)行吸光度測定，以6次測得的吸光度計算RSD為2.49%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取按“2.2.1”項下制備的供試品(3月份采收樣品)溶液，分別在0，1，1.5，2，2.5，3h進(jìn)行吸光度測定，以測得的吸光度計算RSD為0.18%，表明供試品溶液在3h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取6份鉤藤樣品(3月份采收樣品)粉末，每份約0.4g，精密稱定，分別置于6個100mL圓底燒瓶中，按“2.2.1”項下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計在488nm處測定吸光度，計算出該鉤藤藥材中的多糖(按葡萄糖計)的平均含量為7.42%，RSD為2.06%。

2.2.7 加樣回收率試驗 稱取已知多糖平均含量為7.42%的鉤藤樣品粉末6份，每份約0.2g，精密稱定，分別置于100mL圓底燒瓶中，每份分別精密加入濃度為281.18μg/mL的葡萄糖對照品溶液50mL，按“2.2.1”項下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計在488nm處測定吸光度，結(jié)果平均回收率為98.57%，RSD%為2.70。

2.2.8 含量測定 稱取鉤藤樣品，每樣各3份，每份約0.4g，精密稱定，按“2.2.1”項下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計在488nm處測定吸光度，計算出多糖(按葡萄糖計)的含量，結(jié)果見表3。

表3 毛鉤藤不同采收期總生物堿和多糖含量測定結(jié)果(n=3，%)

3 討論

多糖并非毛鉤藤的藥效成分，然而通過實驗觀察到多糖含量與生物堿含量變化存在一定正相關(guān)性，可為分析毛鉤藤內(nèi)在質(zhì)量變化提供輔助信息[4]。

毛鉤藤中的總生物堿在全年通常氣溫相對較高的5～10月份時段含量相對較低，此時段多糖含量也呈現(xiàn)相應(yīng)含量較低的狀態(tài)，而在當(dāng)年11月到次年4月份氣溫相對較低時段總生物堿含量相對較高，此時段多糖含量也呈現(xiàn)相應(yīng)含量較高的狀態(tài)，說明植物體內(nèi)糖份的積累變化與生物堿的含量變化基本一致，氣溫的高低是毛鉤藤中總生物堿及多糖含量有明顯直接影響的因素。因此貴州開陽縣翁昭村毛鉤藤種植基地種植的毛鉤藤采收期應(yīng)選擇氣溫相對較低的時段采收為宜，與中國藥典2010版對鉤藤采收期于“秋、冬二季采收”敘述有一定差異，這或許與特定地點的地理環(huán)境和氣候有密切關(guān)系所致。

[1]國家藥典委員會.中國藥典·一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：240.

[2]曾常青,羅北亮.酸性染料比色法測定鉤藤的總生物堿含量[J].中藥材，2007，30(8)：1021-1024.

[3]國家藥典委員會.中國藥典·一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社.2010：206.

[4]蔣品，高言明，楊玉琴，等.龍膽不同采收期龍膽苦苷和多糖含量變化研究[J].江西中醫(yī)藥，2011,42(2)：55-57.