膨化珍珠巖對牛血清白蛋白的吸附研究*

王 宇，張曉燕

(信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，河南 信陽 464000)

珍珠巖(Perlite)是一種火山噴發(fā)的酸性熔巖，經(jīng)急劇冷卻而成的玻璃質(zhì)巖石，因其具有珍珠裂隙結(jié)構(gòu)而得名。礦石經(jīng)破碎、粉磨和分級至一定的粒度，再置膨化爐內(nèi)在870～1100℃下加熱，從而形成一種發(fā)泡的玻璃質(zhì)材料，被稱為膨化珍珠巖，又稱膨脹珍珠巖。膨化珍珠巖具有多孔、表觀密度輕、導(dǎo)熱系數(shù)低、化學(xué)穩(wěn)定性好、使用溫度范圍廣、無毒、無味、防火等特點，廣泛應(yīng)用于多種工業(yè)部門。

膨化珍珠巖的多孔性，使其具有較強的吸附性能，因此廣泛用作吸附材料。劉涉江等[1]研究表明膨化珍珠巖對有機小分子甲基叔丁基醚有很好的吸附能力，其吸附是吸熱過程，符合Freundlich經(jīng)驗公式；尚建麗等[2]以膨化珍珠巖為載體吸附有機羧酸形成的復(fù)合相變材料，“發(fā)現(xiàn)當(dāng)辛酸含量達到60%時,有細微滲出;當(dāng)月桂酸達到50%時,有細微滲出,當(dāng)豆蔻酸達到45%時,有細微滲出”[2]。 這些研究表明膨化珍珠巖對有機小分子有很好的吸附能力。

牛血清白蛋白 (BSA)是生物化學(xué)實驗中常用的一種蛋白質(zhì)，其分子量 68千道爾頓，等電點 4.8，由 581個氨基酸殘基組成[3]。牛血清白蛋白和人血清白蛋白(HSA)分子是同源蛋白，BSA 的結(jié)構(gòu)與 HSA 具有 76%的相似度[4]。由于植入人體的許多醫(yī)學(xué)材料會因為吸附血清蛋白后產(chǎn)生一系列生理變化，許多研究[5,6]采用牛血清白蛋白為對象來研究這些材料對蛋白的吸附規(guī)律，久而久之牛血清白蛋白成為研究不同材料[7,8,9,10]對蛋白質(zhì)吸附規(guī)律的模式蛋白。

本文初步研究了膨化珍珠巖對牛血清白蛋白的吸附行為，試圖通過對膨化珍珠巖吸附牛血清白蛋白的研究，了解膨化珍珠巖對蛋白質(zhì)這種有機大分子的吸附特性，研究膨化珍珠巖作為固定化酶載體材料的可能性，也為本地珍珠巖產(chǎn)品找到一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 實驗部分

1.1儀器設(shè)備

恒溫水浴震蕩器，UV754N型紫外可見光分光光度計，上海雷磁PHS-3型PH計，電子天平，微量加樣器等。

1.2 實驗材料

1.2.1 膨化珍珠巖材料

膨化珍珠巖材料由信陽匯通珍珠巖實業(yè)有限公司提供。為簡化實驗環(huán)節(jié)，選擇密度略大于水的5號過濾劑作為實驗材料，因其在生產(chǎn)中經(jīng)過高溫加熱及風(fēng)選，實驗前僅使用蒸餾水沖洗干凈后，120℃下烘干7～9小時后，放入干燥器中備用。

1.2.2 藥品及試劑

牛血清白蛋白為市售上海國藥集團生產(chǎn)，其余試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

診斷多重共線性的方法常用的是方差膨脹因子（VIF）法，可根據(jù)方差膨脹因子（VIF）的大小進行判斷。一般地，當(dāng)0＜VIF＜10時可認為指標(biāo)不存在多重共線性。借助SPSS，計算結(jié)果如表4：

由于本研究的目的是希望獲得工廠化生產(chǎn)的固定化酶的載體材料，考慮到以后工業(yè)生產(chǎn)的實際情況，以下實驗的實驗溫度均為25℃。

1.3.1 吸附實驗

稱取一定質(zhì)量的膨化珍珠巖加入離心管中，再分別加入一定體積的牛血清白蛋白溶液，溶液的蛋白質(zhì)濃度和PH值根據(jù)實驗設(shè)計而定，放入恒溫水浴振蕩器中，在200rpm下吸附3h，然后4000轉(zhuǎn)離心15min后收集上清,將沉淀用等體積雙蒸水清洗后4000轉(zhuǎn)離心15min,收集上清，重復(fù)清洗三次；將收集的上清液混合，測定蛋白質(zhì)含量。用初始溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量減去吸附后收集的所有溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，即得到膨化珍珠巖所吸附的牛血清白蛋白的質(zhì)量。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍G-250染色法：稱取一定質(zhì)量的牛血清白蛋白，將其溶解在一定體積的雙蒸水中，用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，最后配置成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。再將標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液用雙蒸水稀釋，配制成一系列濃度梯度的蛋白溶液，取樣與考馬斯亮藍G-250染色液充分混合，靜置10min后在波長為595nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蛋白含量與光吸收值之間的函數(shù)關(guān)系式為：

y=2.786x+0.0182 ，R2=0.999 (y為蛋白質(zhì)毫克數(shù)，x為光吸收值)。

1.3.4 緩沖溶液的配置

緩沖溶液采用洪駿的方法[11]配制。A液:稱取6.008g檸檬酸，3.893g磷酸二氫鉀，1.769g硼酸和5.266g巴比妥，加蒸餾水定容至1000m1；B液：0.2mol/L氫氧化鈉，稱取氫氧化鈉2.0g(分子量40g/mol )，加蒸餾水定容至 250ml，按表1的比例配制：

表1 緩沖溶液的配制方法

2 實驗結(jié)果

2.1 PH值對吸附行為的影響

分別稱取20mg膨化珍珠巖，分別加入PH值分別為3、4、5、6、7、8，蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml的牛血清白蛋白溶液1ml，按照1.3.1的方法進行實驗，結(jié)果如圖1所示：

可以看到在PH值為5的溶液條件下，膨化珍珠巖吸附牛血清白蛋白的量最大。隨著溶液PH值的增大，膨化珍珠巖的吸附能力明顯下降。

圖1 PH值對牛血清蛋白吸附的影響

2.2 25℃條件下的吸附等溫線測定

稱取20mg膨化珍珠巖，分別加入等體積濃度為0.5，0.75，1，1.5，2，2.5，3，4，5mg/ml的BSA溶液，按1.3.1的方法進行實驗，得到298K，PH值為5.0條件下的膨化珍珠巖對BSA的吸附等溫線?；貧w分析表明該曲線的回歸系數(shù)R2=0.905，說明 BSA在膨化珍珠巖表面的吸附基本符合 Langmuir模型[12]。

圖2 膨化珍珠巖的等溫吸附線

2.3 時間對吸附的影響

圖3為時間對吸附行為的影響結(jié)果。從圖上可以看出，隨著時間的增加，蛋白吸附的量在增加。但是當(dāng)超過兩個小時以后，蛋白吸附的量出現(xiàn)下降，隨著時間的增加，下降的幅度趨于平緩。

3 結(jié)論及分析

由于膨化珍珠巖是空隙結(jié)構(gòu)發(fā)達的硅石材料，已經(jīng)有許多科研工作者研究了其吸附特性，魏麗等[13]發(fā)現(xiàn)膨化珍珠巖對硫化物的吸附能力弱于硅藻土、膨潤土和高嶺土，而且曹書勤等[14]研究發(fā)現(xiàn)使用氨基三乙氧基硅烷對膨化珍珠巖表面改性后對2,4- 二硝基苯肼的吸附能力顯著提高，加之前文中劉涉江[1]、尚建麗[2]等的研究，都提示膨化珍珠巖對水溶性有機小分子物質(zhì)有比較好的吸附能力。

本實驗結(jié)果分析表明，膨化珍珠巖對于牛血清白蛋白有很好的吸附能力，其吸附行為符合Langmuir模型，屬于單層分子在均勻表面的吸附。只是通過簡單的調(diào)整溶液的PH值，即可以大大提高吸附效率，達到令人滿意的效果。這意味著膨化珍珠巖對以牛血清白蛋白為典型的軟蛋白類生物大分子有很好的吸附效果，也意味著作為反應(yīng)催化劑的酶蛋白經(jīng)過比較簡單的吸附處理過程就可能得到催化效率比較高的、廉價的、以膨化珍珠巖為載體材料的固定化酶。鑒于膨化珍珠巖具有化學(xué)穩(wěn)定性好、使用溫度范圍廣、無毒、無味、成本低廉等優(yōu)良的性質(zhì)，使用以膨化珍珠巖為載體材料的固定化酶產(chǎn)品，在生產(chǎn)應(yīng)用中基本可以忽略載體材料對酶催化反應(yīng)的干擾，加上珍珠巖工業(yè)已經(jīng)發(fā)展多年，可以提供的材料種類很多，能夠提供的固定化酶產(chǎn)品也會比較豐富，因此這種以膨化珍珠巖為載體材料的固定化酶產(chǎn)品在生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用前景。但是由于膨化珍珠巖中玻璃質(zhì)成分占95%以上，與蛋白質(zhì)結(jié)合的牢固程度可能有一定限制，若想要膨化珍珠巖成為一種理想的固定化酶的載體材料廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，還需進一步深入的研究。

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