固相萃取—高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物的含量

萬(wàn)澤文等

摘 要：建立了水產(chǎn)品中喹乙醇藥物殘留量測(cè)定的固相萃取-高效液相色譜法。樣品勻漿后經(jīng)鹽酸水溶液超聲提取，MAX柱凈化和富集后，采用紫外檢測(cè)器在320 nm處對(duì)喹乙醇代謝物進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，喹乙醇代謝物分離效果好，檢出限（LOD）為4.0μg/kg，定量限（LOQ）為12.0 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%～8.03% （n=6），加標(biāo)回收率達(dá)到71.5%～89.2%。該方法具有比較高的重現(xiàn)性和選擇性，在水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物的殘留測(cè)定中具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：固相萃??；高效液相色譜法；喹乙醇代謝物；水產(chǎn)品

喹乙醇（olaquindox， OLA）又稱(chēng)喹酰胺醇，是一種促生長(zhǎng)作用的飼料添加劑，可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率和利用率，被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物飼料添加劑。喹乙醇對(duì)魚(yú)類(lèi)致病菌均有較好的抑制作用，可用于治療淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)敗血癥等病癥的防治。但是喹乙醇添加過(guò)量會(huì)引起中毒，且對(duì)大部分動(dòng)物有致畸作用，對(duì)人類(lèi)也有潛在的三致作用。因此喹乙醇在動(dòng)物源性食品中的殘留引起人們的重視，世界大多數(shù)國(guó)家禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖和治療中使用喹乙醇，歐盟在EC 2788/98決議中將喹乙醇列為禁用藥。我國(guó)也明文規(guī)定禁止將喹乙醇用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖。

目前喹乙醇代謝物的檢測(cè)方法是高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法提高了對(duì)目標(biāo)物的準(zhǔn)確性和靈敏度，但是由于儀器昂貴，檢測(cè)成本高，不易推廣。高效液相色譜法在使用上方便、快捷，靈敏度也達(dá)到要求，因此本文通過(guò)簡(jiǎn)化前處理過(guò)程，采用固相萃取方式進(jìn)行凈化，利用紫外檢測(cè)器對(duì)喹乙醇代謝物進(jìn)行了檢測(cè)，縮短了前處理時(shí)間，靈敏度高，能實(shí)現(xiàn)對(duì)喹乙醇代謝物的快速檢測(cè)，滿足水產(chǎn)品質(zhì)檢以及相關(guān)基礎(chǔ)研究的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，配備2489紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器；高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）；超聲波清洗器（昆山超聲波儀器廠）；精密電子天平（梅特勒-托利多稱(chēng)重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）；微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)R-Biopharm 公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙酸乙酯（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；MAX固相萃取柱（3 cc/60 mg，美國(guó)色譜科）。

1.2 樣品前處理

稱(chēng)取5 g（精確至0.01 g）樣品至于50 mL離心管中，向離心管中加入10 mL2mol/L鹽酸溶液提取，漩渦混勻后超聲提取20min，8000 r/min離心10 min，上清液倒入新的離心管中，重復(fù)操作一次，合并提取液。取MAX固相萃取柱（3 mL/60 mg）用5 mL甲醇、5mL水活化，將備用液過(guò)柱，再用10 mL含2%甲酸的乙酸乙酯洗脫，收集提取液和洗脫液，40 ℃氮?dú)庀麓蹈桑?.0 mL流動(dòng)相定容過(guò)0.45 μm濾膜，濾液供液相色譜測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A甲醇，B為水（添加1.0%甲酸）；流動(dòng)相比例為（A：B，40：60）流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

選擇合適的流動(dòng)相使目標(biāo)物能較好的分離，不妨礙檢測(cè)器的正常工作在波長(zhǎng)范圍無(wú)吸收并且保護(hù)色譜柱，保證合適的柱壓。本文比較了甲醇-水、甲醇-水（1.0%甲酸）兩種不同的流動(dòng)相，經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入一定量的酸使喹乙醇代謝物的目標(biāo)物峰形更加尖銳，檢測(cè)靈敏度也得到提高，但是酸性過(guò)高的，會(huì)影響色譜柱的壽命，本文選擇在水中加入1.0%甲酸控制溶液pH值，得到較好的分離效果，見(jiàn)圖1。

2.2 提取方式的優(yōu)化

目前喹乙醇代謝物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-5-2008《水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜法》，該方法前處理簡(jiǎn)單，但是由于采用該法在萃取和反萃取過(guò)程中，目標(biāo)物容易流失，造成回收率偏低，而且懸浮物較多容易堵塞濾膜，上機(jī)液體較渾濁，不但影響回收率而且會(huì)對(duì)色譜柱造成損害。本文采取用鹽酸水解提取喹乙醇代謝物，超聲振蕩提取，混合陰離子柱凈化，可顯著的提高對(duì)目標(biāo)物的回收率。

2.3 固相萃取柱的選擇

固相萃取是一種色譜分離的前處理方法，主要依靠固相萃取柱來(lái)進(jìn)行凈化，不同的基質(zhì)選擇不同材料的固相萃取柱，填料的類(lèi)型決定了吸附能力的大小以及回收率的高低。針對(duì)極性較大的樣品，凈化主要采用陰離子交換柱來(lái)實(shí)現(xiàn)，陰離子交換柱適合酸性化合物的凈化和富集，一般采用堿性溶液活化，酸性溶液洗脫，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇和水活化，使填料對(duì)陰離子和非極性分子的吸附活性，使目標(biāo)物保持正離子態(tài)吸附保留在柱上，提高填料對(duì)目標(biāo)物的吸附活性，在洗脫時(shí)，加入酸性的有機(jī)溶液使填料失活解吸，從而使目標(biāo)物從填料中洗脫下來(lái)。

本文比較了四種不同的固相萃取柱（C18 500mg/3mL，HLB 60mg/3 mL，Alumina-N 60mg/ 3mL，MAX 60 mg /3 mL）對(duì)喹乙醇代謝物的凈化效果，其回收率的結(jié)果見(jiàn)圖2，本實(shí)驗(yàn)選擇利用MAX柱（3mL/60mg），步驟簡(jiǎn)單，凈化效果好。

2.4 線性范圍和靈敏度

用流動(dòng)相將喹乙醇代謝物儲(chǔ)備液稀釋成0.02、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照其所得峰面積的平均值與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得喹乙醇代謝物在質(zhì)量濃度0.02～5.0mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=23.54X+63.88，相關(guān)性系數(shù)大于0.9997，見(jiàn)圖3。由此可知喹乙醇代謝物在0.02～5.0mg/L范圍內(nèi)其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，可滿足定量分析的要求。

在方法規(guī)定的取樣質(zhì)量條件下，在陰性樣品中添加喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加水平為4.0 μg/kg）經(jīng)測(cè)定信噪比（S/N）均大于3，表明目標(biāo)物的檢測(cè)下限（LOD）為4.0 μg/kg，在陰性樣品中添加喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加水平為12.0 μg/kg）經(jīng)測(cè)定信噪比（S/N）均大于10，表明其定量下限（LOQ）可為12.0 μg/kg?？瞻鬃V圖及加標(biāo)圖見(jiàn)圖4。2.5 回收率和精密度

在不同的水產(chǎn)品中（草魚(yú)、中華鱉、對(duì)蝦）分別添加2、20、40 ng/g三個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)添加水平設(shè)6個(gè)平行，按1.2節(jié)所述條件進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，可得到回收率為71.5%～89.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%～8.03%，結(jié)果見(jiàn)表1。說(shuō)明能取得良好的回收效果。

3 小結(jié)

本文建立了固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物含量的檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)前處理?xiàng)l件以及色譜條件的優(yōu)化，喹乙醇代謝物在0.02～5.0 mg/L范圍內(nèi)其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，檢出限LOD為4.0 μg/kg，定量限LOQ為12.0 μg/kg；在不同的添加水平下，喹乙醇代謝物各組分的平均回收率在為71.5%～89.2%%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%～8.03%，符合國(guó)內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求。該方法并可為喹乙醇代謝物在水產(chǎn)品中的消除規(guī)律及毒理評(píng)價(jià)提供靈敏、準(zhǔn)確的分析手段，對(duì)食品的安全工作提供了有力的保障。

參考文獻(xiàn)（略）

摘 要：建立了水產(chǎn)品中喹乙醇藥物殘留量測(cè)定的固相萃取-高效液相色譜法。樣品勻漿后經(jīng)鹽酸水溶液超聲提取，MAX柱凈化和富集后，采用紫外檢測(cè)器在320 nm處對(duì)喹乙醇代謝物進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，喹乙醇代謝物分離效果好，檢出限（LOD）為4.0μg/kg，定量限（LOQ）為12.0 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%～8.03% （n=6），加標(biāo)回收率達(dá)到71.5%～89.2%。該方法具有比較高的重現(xiàn)性和選擇性，在水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物的殘留測(cè)定中具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：固相萃取；高效液相色譜法；喹乙醇代謝物；水產(chǎn)品

喹乙醇（olaquindox， OLA）又稱(chēng)喹酰胺醇，是一種促生長(zhǎng)作用的飼料添加劑，可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率和利用率，被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物飼料添加劑。喹乙醇對(duì)魚(yú)類(lèi)致病菌均有較好的抑制作用，可用于治療淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)敗血癥等病癥的防治。但是喹乙醇添加過(guò)量會(huì)引起中毒，且對(duì)大部分動(dòng)物有致畸作用，對(duì)人類(lèi)也有潛在的三致作用。因此喹乙醇在動(dòng)物源性食品中的殘留引起人們的重視，世界大多數(shù)國(guó)家禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖和治療中使用喹乙醇，歐盟在EC 2788/98決議中將喹乙醇列為禁用藥。我國(guó)也明文規(guī)定禁止將喹乙醇用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖。

目前喹乙醇代謝物的檢測(cè)方法是高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法提高了對(duì)目標(biāo)物的準(zhǔn)確性和靈敏度，但是由于儀器昂貴，檢測(cè)成本高，不易推廣。高效液相色譜法在使用上方便、快捷，靈敏度也達(dá)到要求，因此本文通過(guò)簡(jiǎn)化前處理過(guò)程，采用固相萃取方式進(jìn)行凈化，利用紫外檢測(cè)器對(duì)喹乙醇代謝物進(jìn)行了檢測(cè)，縮短了前處理時(shí)間，靈敏度高，能實(shí)現(xiàn)對(duì)喹乙醇代謝物的快速檢測(cè)，滿足水產(chǎn)品質(zhì)檢以及相關(guān)基礎(chǔ)研究的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，配備2489紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器；高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）；超聲波清洗器（昆山超聲波儀器廠）；精密電子天平（梅特勒-托利多稱(chēng)重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）；微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)R-Biopharm 公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙酸乙酯（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；MAX固相萃取柱（3 cc/60 mg，美國(guó)色譜科）。

1.2 樣品前處理

稱(chēng)取5 g（精確至0.01 g）樣品至于50 mL離心管中，向離心管中加入10 mL2mol/L鹽酸溶液提取，漩渦混勻后超聲提取20min，8000 r/min離心10 min，上清液倒入新的離心管中，重復(fù)操作一次，合并提取液。取MAX固相萃取柱（3 mL/60 mg）用5 mL甲醇、5mL水活化，將備用液過(guò)柱，再用10 mL含2%甲酸的乙酸乙酯洗脫，收集提取液和洗脫液，40 ℃氮?dú)庀麓蹈?，?.0 mL流動(dòng)相定容過(guò)0.45 μm濾膜，濾液供液相色譜測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A甲醇，B為水（添加1.0%甲酸）；流動(dòng)相比例為（A：B，40：60）流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

選擇合適的流動(dòng)相使目標(biāo)物能較好的分離，不妨礙檢測(cè)器的正常工作在波長(zhǎng)范圍無(wú)吸收并且保護(hù)色譜柱，保證合適的柱壓。本文比較了甲醇-水、甲醇-水（1.0%甲酸）兩種不同的流動(dòng)相，經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入一定量的酸使喹乙醇代謝物的目標(biāo)物峰形更加尖銳，檢測(cè)靈敏度也得到提高，但是酸性過(guò)高的，會(huì)影響色譜柱的壽命，本文選擇在水中加入1.0%甲酸控制溶液pH值，得到較好的分離效果，見(jiàn)圖1。

2.2 提取方式的優(yōu)化

目前喹乙醇代謝物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-5-2008《水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜法》，該方法前處理簡(jiǎn)單，但是由于采用該法在萃取和反萃取過(guò)程中，目標(biāo)物容易流失，造成回收率偏低，而且懸浮物較多容易堵塞濾膜，上機(jī)液體較渾濁，不但影響回收率而且會(huì)對(duì)色譜柱造成損害。本文采取用鹽酸水解提取喹乙醇代謝物，超聲振蕩提取，混合陰離子柱凈化，可顯著的提高對(duì)目標(biāo)物的回收率。

2.3 固相萃取柱的選擇

固相萃取是一種色譜分離的前處理方法，主要依靠固相萃取柱來(lái)進(jìn)行凈化，不同的基質(zhì)選擇不同材料的固相萃取柱，填料的類(lèi)型決定了吸附能力的大小以及回收率的高低。針對(duì)極性較大的樣品，凈化主要采用陰離子交換柱來(lái)實(shí)現(xiàn)，陰離子交換柱適合酸性化合物的凈化和富集，一般采用堿性溶液活化，酸性溶液洗脫，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇和水活化，使填料對(duì)陰離子和非極性分子的吸附活性，使目標(biāo)物保持正離子態(tài)吸附保留在柱上，提高填料對(duì)目標(biāo)物的吸附活性，在洗脫時(shí)，加入酸性的有機(jī)溶液使填料失活解吸，從而使目標(biāo)物從填料中洗脫下來(lái)。

本文比較了四種不同的固相萃取柱（C18 500mg/3mL，HLB 60mg/3 mL，Alumina-N 60mg/ 3mL，MAX 60 mg /3 mL）對(duì)喹乙醇代謝物的凈化效果，其回收率的結(jié)果見(jiàn)圖2，本實(shí)驗(yàn)選擇利用MAX柱（3mL/60mg），步驟簡(jiǎn)單，凈化效果好。

2.4 線性范圍和靈敏度

用流動(dòng)相將喹乙醇代謝物儲(chǔ)備液稀釋成0.02、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照其所得峰面積的平均值與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得喹乙醇代謝物在質(zhì)量濃度0.02～5.0mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=23.54X+63.88，相關(guān)性系數(shù)大于0.9997，見(jiàn)圖3。由此可知喹乙醇代謝物在0.02～5.0mg/L范圍內(nèi)其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，可滿足定量分析的要求。

在方法規(guī)定的取樣質(zhì)量條件下，在陰性樣品中添加喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加水平為4.0 μg/kg）經(jīng)測(cè)定信噪比（S/N）均大于3，表明目標(biāo)物的檢測(cè)下限（LOD）為4.0 μg/kg，在陰性樣品中添加喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加水平為12.0 μg/kg）經(jīng)測(cè)定信噪比（S/N）均大于10，表明其定量下限（LOQ）可為12.0 μg/kg?？瞻鬃V圖及加標(biāo)圖見(jiàn)圖4。2.5 回收率和精密度

在不同的水產(chǎn)品中（草魚(yú)、中華鱉、對(duì)蝦）分別添加2、20、40 ng/g三個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)添加水平設(shè)6個(gè)平行，按1.2節(jié)所述條件進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，可得到回收率為71.5%～89.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%～8.03%，結(jié)果見(jiàn)表1。說(shuō)明能取得良好的回收效果。

3 小結(jié)

本文建立了固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物含量的檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)前處理?xiàng)l件以及色譜條件的優(yōu)化，喹乙醇代謝物在0.02～5.0 mg/L范圍內(nèi)其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，檢出限LOD為4.0 μg/kg，定量限LOQ為12.0 μg/kg；在不同的添加水平下，喹乙醇代謝物各組分的平均回收率在為71.5%～89.2%%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%～8.03%，符合國(guó)內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求。該方法并可為喹乙醇代謝物在水產(chǎn)品中的消除規(guī)律及毒理評(píng)價(jià)提供靈敏、準(zhǔn)確的分析手段，對(duì)食品的安全工作提供了有力的保障。

參考文獻(xiàn)（略）

摘 要：建立了水產(chǎn)品中喹乙醇藥物殘留量測(cè)定的固相萃取-高效液相色譜法。樣品勻漿后經(jīng)鹽酸水溶液超聲提取，MAX柱凈化和富集后，采用紫外檢測(cè)器在320 nm處對(duì)喹乙醇代謝物進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，喹乙醇代謝物分離效果好，檢出限（LOD）為4.0μg/kg，定量限（LOQ）為12.0 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%～8.03% （n=6），加標(biāo)回收率達(dá)到71.5%～89.2%。該方法具有比較高的重現(xiàn)性和選擇性，在水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物的殘留測(cè)定中具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：固相萃取；高效液相色譜法；喹乙醇代謝物；水產(chǎn)品

喹乙醇（olaquindox， OLA）又稱(chēng)喹酰胺醇，是一種促生長(zhǎng)作用的飼料添加劑，可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率和利用率，被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物飼料添加劑。喹乙醇對(duì)魚(yú)類(lèi)致病菌均有較好的抑制作用，可用于治療淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)敗血癥等病癥的防治。但是喹乙醇添加過(guò)量會(huì)引起中毒，且對(duì)大部分動(dòng)物有致畸作用，對(duì)人類(lèi)也有潛在的三致作用。因此喹乙醇在動(dòng)物源性食品中的殘留引起人們的重視，世界大多數(shù)國(guó)家禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖和治療中使用喹乙醇，歐盟在EC 2788/98決議中將喹乙醇列為禁用藥。我國(guó)也明文規(guī)定禁止將喹乙醇用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖。

目前喹乙醇代謝物的檢測(cè)方法是高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法提高了對(duì)目標(biāo)物的準(zhǔn)確性和靈敏度，但是由于儀器昂貴，檢測(cè)成本高，不易推廣。高效液相色譜法在使用上方便、快捷，靈敏度也達(dá)到要求，因此本文通過(guò)簡(jiǎn)化前處理過(guò)程，采用固相萃取方式進(jìn)行凈化，利用紫外檢測(cè)器對(duì)喹乙醇代謝物進(jìn)行了檢測(cè)，縮短了前處理時(shí)間，靈敏度高，能實(shí)現(xiàn)對(duì)喹乙醇代謝物的快速檢測(cè)，滿足水產(chǎn)品質(zhì)檢以及相關(guān)基礎(chǔ)研究的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，配備2489紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器；高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）；超聲波清洗器（昆山超聲波儀器廠）；精密電子天平（梅特勒-托利多稱(chēng)重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）；微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)R-Biopharm 公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙酸乙酯（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；MAX固相萃取柱（3 cc/60 mg，美國(guó)色譜科）。

1.2 樣品前處理

稱(chēng)取5 g（精確至0.01 g）樣品至于50 mL離心管中，向離心管中加入10 mL2mol/L鹽酸溶液提取，漩渦混勻后超聲提取20min，8000 r/min離心10 min，上清液倒入新的離心管中，重復(fù)操作一次，合并提取液。取MAX固相萃取柱（3 mL/60 mg）用5 mL甲醇、5mL水活化，將備用液過(guò)柱，再用10 mL含2%甲酸的乙酸乙酯洗脫，收集提取液和洗脫液，40 ℃氮?dú)庀麓蹈?，?.0 mL流動(dòng)相定容過(guò)0.45 μm濾膜，濾液供液相色譜測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A甲醇，B為水（添加1.0%甲酸）；流動(dòng)相比例為（A：B，40：60）流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

選擇合適的流動(dòng)相使目標(biāo)物能較好的分離，不妨礙檢測(cè)器的正常工作在波長(zhǎng)范圍無(wú)吸收并且保護(hù)色譜柱，保證合適的柱壓。本文比較了甲醇-水、甲醇-水（1.0%甲酸）兩種不同的流動(dòng)相，經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入一定量的酸使喹乙醇代謝物的目標(biāo)物峰形更加尖銳，檢測(cè)靈敏度也得到提高，但是酸性過(guò)高的，會(huì)影響色譜柱的壽命，本文選擇在水中加入1.0%甲酸控制溶液pH值，得到較好的分離效果，見(jiàn)圖1。

2.2 提取方式的優(yōu)化

目前喹乙醇代謝物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-5-2008《水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜法》，該方法前處理簡(jiǎn)單，但是由于采用該法在萃取和反萃取過(guò)程中，目標(biāo)物容易流失，造成回收率偏低，而且懸浮物較多容易堵塞濾膜，上機(jī)液體較渾濁，不但影響回收率而且會(huì)對(duì)色譜柱造成損害。本文采取用鹽酸水解提取喹乙醇代謝物，超聲振蕩提取，混合陰離子柱凈化，可顯著的提高對(duì)目標(biāo)物的回收率。

2.3 固相萃取柱的選擇

固相萃取是一種色譜分離的前處理方法，主要依靠固相萃取柱來(lái)進(jìn)行凈化，不同的基質(zhì)選擇不同材料的固相萃取柱，填料的類(lèi)型決定了吸附能力的大小以及回收率的高低。針對(duì)極性較大的樣品，凈化主要采用陰離子交換柱來(lái)實(shí)現(xiàn)，陰離子交換柱適合酸性化合物的凈化和富集，一般采用堿性溶液活化，酸性溶液洗脫，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇和水活化，使填料對(duì)陰離子和非極性分子的吸附活性，使目標(biāo)物保持正離子態(tài)吸附保留在柱上，提高填料對(duì)目標(biāo)物的吸附活性，在洗脫時(shí)，加入酸性的有機(jī)溶液使填料失活解吸，從而使目標(biāo)物從填料中洗脫下來(lái)。

本文比較了四種不同的固相萃取柱（C18 500mg/3mL，HLB 60mg/3 mL，Alumina-N 60mg/ 3mL，MAX 60 mg /3 mL）對(duì)喹乙醇代謝物的凈化效果，其回收率的結(jié)果見(jiàn)圖2，本實(shí)驗(yàn)選擇利用MAX柱（3mL/60mg），步驟簡(jiǎn)單，凈化效果好。

2.4 線性范圍和靈敏度

用流動(dòng)相將喹乙醇代謝物儲(chǔ)備液稀釋成0.02、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照其所得峰面積的平均值與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得喹乙醇代謝物在質(zhì)量濃度0.02～5.0mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=23.54X+63.88，相關(guān)性系數(shù)大于0.9997，見(jiàn)圖3。由此可知喹乙醇代謝物在0.02～5.0mg/L范圍內(nèi)其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，可滿足定量分析的要求。

在方法規(guī)定的取樣質(zhì)量條件下，在陰性樣品中添加喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加水平為4.0 μg/kg）經(jīng)測(cè)定信噪比（S/N）均大于3，表明目標(biāo)物的檢測(cè)下限（LOD）為4.0 μg/kg，在陰性樣品中添加喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加水平為12.0 μg/kg）經(jīng)測(cè)定信噪比（S/N）均大于10，表明其定量下限（LOQ）可為12.0 μg/kg?？瞻鬃V圖及加標(biāo)圖見(jiàn)圖4。2.5 回收率和精密度

在不同的水產(chǎn)品中（草魚(yú)、中華鱉、對(duì)蝦）分別添加2、20、40 ng/g三個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)添加水平設(shè)6個(gè)平行，按1.2節(jié)所述條件進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，可得到回收率為71.5%～89.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%～8.03%，結(jié)果見(jiàn)表1。說(shuō)明能取得良好的回收效果。

3 小結(jié)

本文建立了固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物含量的檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)前處理?xiàng)l件以及色譜條件的優(yōu)化，喹乙醇代謝物在0.02～5.0 mg/L范圍內(nèi)其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，檢出限LOD為4.0 μg/kg，定量限LOQ為12.0 μg/kg；在不同的添加水平下，喹乙醇代謝物各組分的平均回收率在為71.5%～89.2%%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%～8.03%，符合國(guó)內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求。該方法并可為喹乙醇代謝物在水產(chǎn)品中的消除規(guī)律及毒理評(píng)價(jià)提供靈敏、準(zhǔn)確的分析手段，對(duì)食品的安全工作提供了有力的保障。

參考文獻(xiàn)（略）