動態(tài)負荷力對軟骨前體干細胞甲狀旁腺激素相關肽的影響及細胞外基質蛋白組研究

靳松 彭建強 林昆 黃愛軍 李亞杰

力學刺激對軟骨細胞的功能活動及骨的正常發(fā)育與成熟具有重要影響，而甲狀旁腺激素相關肽(PTHrP) 在骺板軟骨分化發(fā)育中起關鍵作用，在鈣磷代謝、骨礦化等方面發(fā)揮生物學作用[1]。骺板軟骨前體干細胞(PSC)是骺板周圍軟骨膜及靜止區(qū)中存在的一類可以分裂增殖、自我更新的成體干細胞[2]。本研究采用動態(tài)壓力細胞培養(yǎng)裝置對體外培養(yǎng)的骺板軟骨PSC予不同強度和持續(xù)時間的壓力刺激，探討其對PTHrP mRNA表達水平的影響及相互聯系，并借助于蛋白質組學技術，尋找和發(fā)現動態(tài)壓力作用下調控軟骨細胞代謝和功能改變的特定的蛋白質分子，為動態(tài)壓力作用下軟骨改建機制的更深入研究提供依據。

材料與方法

一、實驗動物

健康新生24 h SD大鼠，SPF清潔級，雌雄不限，體質量(5.2±0.5)g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物合格證編號為粵檢證字2002A015號。

二、主要試劑及儀器

胎牛血清(Gibco公司，美國)，胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、瓊脂糖(Sigma公司，美國)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)，兔多克隆成纖維細胞生長因子受體-3(FGFR-3)抗體(SantaCruz公司，美國)，Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)，逆轉錄試劑盒(Toyobo公司，日本)， PCR試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)；miniMACS磁性細胞分選系統及相關試劑(Miltenyi公司，德國)，細胞培養(yǎng)箱(Forma公司，美國)，倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)，熒光顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)，PCR儀(Eppendorf公司，德國)，凝膠成像分析系統(Bio-RAD公司，美國)，可控動態(tài)細胞壓力加載裝置(由中山大學骨科研究所提供)。

三、實驗方法

1.骺板軟骨PSC的分離純化及培養(yǎng)鑒定

根據文獻[3]的方法，以顯微手術器械剪取股骨下端骺板兩端的軟骨膜組織充分剪碎，用2.5 g/L胰蛋白酶消化5 min后離心2 min，棄上清后用1.0 g/L Ⅱ型膠原酶37℃消化2 h，200目濾網過濾，離心8 min后收集細胞，調整密度后接種于含體積分數為10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用miniMACS磁性細胞分選系統分離純化PSC，原代細胞消化后通過單細胞濾器懸浮于Buffer溶液中，加入多克隆抗體FGFR-3，孵育15 min，離心洗滌后加入免疫磁珠室溫孵育15 min，洗滌后通過磁場，按使用說明獲得純化后的FGFR-3陽性細胞。收集第3代PSC，用免疫熒光試劑盒檢測細胞FGFR-3的表達情況。

2.實驗分組及處理

將體外培養(yǎng)的第3代PSC分為30、60、90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)組和對照組，各組再分2、6、24 h 3個時間點亞組，總計12組，每組3個樣本。采用開放式壓力控制培養(yǎng)系統，通過壓力表觀察具體壓力數值并記錄加壓時間。

3.半定量PCR

用Trizol一步法提取各組細胞總RNA(具體操作按說明書步驟進行)，分光光度計檢測濃度及純度，取1 μg總RNA按逆轉錄試劑盒一步法得到模板DNA。然后取各組模板DNA 1 μl分別加入上、下游引物(10 μmol)各1 μl、2倍體積PCR Taq混和物12.5 μl (含100 mmol KCl，20 mmol Tris-HCl，3 mmol MgCl2，500 μmol dNTP 混和物，0.1 U/μl Taq DNA聚合酶等)，補足超純水至25 μl。PCR擴增：95℃預變性3 min，于94℃變性20 s，退火20 s，72℃延伸15 s，退火溫度60℃及循環(huán)32次。PTHrP基因的引物序列，正向5’-GACTTGCCCTTGTCATGCAGT-3’，反向5’-GGAGCGTCCTGGTGTTCCT-3’。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參。制備2%瓊脂糖凝膠，對各組PCR產物進行電泳，結束后用凝膠成像系統分析軟件照相，并對各電泳條帶吸光灰度度值進行分析。

4.雙向電泳圖像分析和差異斑點的質譜鑒定

參考文獻[4]的方法，設置參數，處理分離樣品蛋白組織。使用歐洲分子生物學實驗室(EMBL)法行銀染色。掃描圖像后采用ImageMaster 2-D Elite Software 5.0圖像分析軟件對凝膠進行分析，以蛋白點體積為指標，點體積圖像小于1.0×e5及大于1.0×e8(蛋白質點過小及過大) 的蛋白質點不納入差異分析，用DeCyder V6.0 分析軟件行DeCye膠內差異分析，尋找差異表達蛋白點，蛋白點平均體積差異大于2倍(表達差異上調2倍或下調2倍)。使用全自動凝膠斑點處理工作站從凝膠中切出斑點，干燥、胰蛋白酶解與基質混合后，使用基質輔助激光解吸/離子化飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀進行肽質量指紋圖譜鑒定(PMF)。使用胰蛋白酶自切峰(842.509，2 211.104)作內標矯正，使用Frofound軟件在美國國家生物技術信息中心非冗余(nr)數據庫檢索結果。

四、統計學處理

結 果

一、原代細胞和傳代細胞的倒置顯微鏡觀察

采用免疫磁珠分選系統剛分離的PSC呈圓形，折光性好，12 h后開始沉降貼壁，逐漸伸展為多邊形，胞質豐富，細胞呈單層生長(圖1A)。細胞傳至第3代后的細胞狀態(tài)較好，增殖速度較快，細胞FGFR-3免疫熒光染色仍呈陽性表達(圖1B)；隨著傳代次數增加，細胞逐漸以梭形為主，折光性降低，細胞增殖速度明顯減慢。

圖1 PSC的顯微鏡下形態(tài)學觀察(×200)

二、不同強度和刺激時間對PSC PTHrP mRNA表達水平的影響

電泳圖像顯示，各組細胞均有不同程度的PTHrP mRNA表達，見圖2A。各時間點不同壓力強度組間比較差異有統計學意義(F=9.597，P<0.05)，壓力值越大，相同時間點mRNA相對表達量越高。細胞給予動態(tài)壓力刺激2 h后，各實驗組PTHrP mRNA的表達水平均高于對照組 (P均<0.01)；隨著刺激時間的延長，PTHrP mRNA的表達水平也逐漸升高。刺激24 h后各實驗組PTHrP mRNA的表達水平明顯高于對照組(P均<0.01)，見圖2B。

圖2 動態(tài)壓應力作用下不同強度和時間點PTHrP mRNA表達情況

三、不同強度和刺激時間對PSC細胞外基質蛋白質組表達水平的影響

在對照組和實驗組間呈差異表達共有6種蛋白質，分別為：脯氨酰羥化酶α亞單位(PHα)、丙酮酸激酶(PK)、L-乳酸脫氫酶(LDH)、脯氨酰羥化酶β亞單位(PHβ)、細胞骨架蛋白destrin和烯醇酶(enolase)，見圖3及圖4。兩組間6種蛋白定量比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，見圖5。

圖3 實驗組(A)和對照組(B)雙向電泳圖譜

圖4 實驗組和對照組雙向電泳圖譜差異斑點放大圖

圖5 6種差異蛋白在正常對照組和實驗組的表達比較

討 論

力學刺激作為細胞外信號，通過信號轉導可引起骺板細胞內生物活性物質的一系列變化，進而影響細胞功能代謝，但是軟骨細胞對不同性質的力學刺激有不同反應的機制以及體內激素、相關細胞因子的變化和聯系尚不明確。有報道，軟骨細胞的增殖分化在壓力下改變較為明顯，這可能與細胞PTHrP的表達改變有關[5]。PTHrP在各種種屬發(fā)育和成熟的組織中廣泛表達，主要通過旁分泌和自分泌途徑進行調節(jié)，在鈣磷代謝、骨礦化和細胞生長分化、細胞外基質分泌等許多方面發(fā)揮重要生物學作用。本研究顯示，PSC在動態(tài)壓力培養(yǎng)環(huán)境下，各時間點PTHrP表達水平均明顯高于對照組；PTHrP mRNA的表達水平隨時間增加而升高；同一時間點，壓力越大， PTHrP mRNA表達水平越高。結果提示適當的負荷力刺激能上調PTHrP表達水平，PTHrP在力學信號轉導過程中可能起重要作用。

本研究進一步借助蛋白質組學技術，尋找和發(fā)現動態(tài)壓力作用下調控軟骨細胞代謝和功能改變的特定的蛋白質分子。結果發(fā)現了6種在對照組與實驗組間呈差異表達的蛋白質，分別為代謝相關酶(如烯醇酶、PK、LDH、PHα、PHβ)和細胞骨架蛋白destrin。

脯氨酰羥化酶(PH)屬于二硫化物異構酶，可引起蛋白外表結構發(fā)生改變，在人類主要存在α、β、γ3個亞型，其中PHα和PHβ在軟骨細胞Ⅱ型膠原的合成中起重要作用[6]。PHα和PHβ在正常和骨關節(jié)炎軟骨中均有表達，骨關節(jié)炎患者的PHβ表達水平可有升高。PK廣泛存在于人體各組織細胞漿內，是糖酵解途徑3個關鍵調節(jié)酶之一。PK催化磷酸烯醇式丙酮酸轉變?yōu)楸?，影響糖酵解的速度。有報道，正常細胞PK活性處于低水平，當局部缺血、缺氧，PK活性明顯增高[7]。LDH是一種普遍存在的細胞溶質酶，主要催化糖酵解。既往研究顯示，健康軟骨中的LDH水平從表面到深層逐漸下降，而在病變軟骨中缺乏LDH表達[8]。Actin細胞骨架結構被認為是軟骨細胞表型的重要調節(jié)者，其主要作用是維持細胞的機械完整性。Destrin屬于肌動蛋白Actin黏附蛋白ADF家族，其基因編碼了Actin的脫聚合物Cofilin，可提高體內Actin的轉化率[9]。烯醇酶是參與糖酵解的一組酶，其催化2-磷酸甘油酸向烯醇式丙酮酸的轉化，在ATP的合成代謝過程中起重要作用[10]。烯醇酶除了在糖酵解過程中發(fā)揮作用，還是缺氧誘導因子的靶基因，在調節(jié)細胞凋亡和增殖上起關鍵的作用。業(yè)已證實，在低氧環(huán)境和前炎癥因子刺激下烯醇酶水平升高，而這兩個都是軟骨破壞的重要因素[11]。本研究顯示，在給予PSC 90 mm Hg持續(xù)24 h的動態(tài)壓力后，發(fā)生改變的蛋白多數是能量代謝蛋白，而且實驗組的6種蛋白質表達水平均高于對照組，可能是壓力刺激作用于PSC，促進了軟骨基質的生物合成和轉化，促使軟骨改建。但實驗所得陽性意義的信息畢竟是有限的，除去實驗方法本身客觀存在的局限性之外，實驗操作太過繁瑣，實驗周期漫長，且實驗消耗也是相當昂貴的。雖然得到了6個陽性結果，但調控其表達的上下游關系還不清楚，其所代表的壓力作用下調控關節(jié)軟骨細胞的信號分子通路也不得而知，同時，候選蛋白也只是代表了翻譯水平的差異，對其功能認識還需要進一步探討研究。

總之，本研究通過差異蛋白質組學研究發(fā)現了動態(tài)壓力作用下調控終板軟骨細胞生物學行為的6個有意義的關鍵蛋白質，并推測了其在軟骨改建中的作用。為今后研究這些差異蛋白在骺板軟骨細胞受壓力刺激后代謝和功能變化的生物學作用提供了實驗依據。

[1] Longo A, Librizzi M, Naselli F,et al. PTHrP in differentiating human mesenchymal stem cells: Transcript isoform expression, promoter methylation, and protein accumulation. Biochimie，2013，95：1888-1896.

[2] Guo X, Chu X, Li W, et al. Chondrogenic effect of precartilaginous stem cells following NLS-TAT cell penetrating peptide-assisted transfection of eukaryotic hTGFβ3. J Cell Biochem，2013，114：2588-2594.

[3] 李貴剛，張迪，李昆朋，等. 動態(tài)壓應力對生長板軟骨前體干細胞PTHrP及細胞外基質mRNA表達的影響 .中華小兒外科雜志，2010，31：382-386.

[4] Jin S, Shen JN, Guo QC, et al. 2-D DIGE and?MALDI-TOF-MS analysis of the serum proteome in human osteosarcoma. Proteomics Clin Appl，2007，1：272-285.

[5] 胡靜, 鄒淑娟. 機械牽張對人成骨樣細胞增殖能力的影響. 實用口腔醫(yī)學雜志, 2002, 18：447-448.

[6] Pan PW, Zhang Q, Bai F, et al. Profiling and comparative analysis of glycoproteins in Hs578BST and Hs578T and investigation ofprolyl 4-hydroxylase alpha polypeptide II expression and influence in breast cancer cells. Biochemistry (Mosc)，2012，77：539-545.

[7] Bluemlein K, Glückmann M, Grüning NM, et al. Pyruvate kinase is a dosage-dependent regulator of cellular amino acid homeostasis. Oncotarget，2012，3：1356-1369.

[8] Doughty MJ. Impact of hypotonic solutions on the stromal swelling, lactate dehydrogenase and aldehydedehydrogenase activity of the keratocytes of the bovine cornea. Cell Biol Int，2004，28：593-607.

[9] Jin K, Ren DD, Chi FL, et al. Changes in ADF/destrin expression in the development of hair cells following Atoh1-induced ectopic regeneration. Exp Ther Med，2013，6：177-183.

[10] Marzoni M, Castillo A, Sagona S, et al. A proteomic approach to identify seminal plasma proteins in roosters (Gallus gallus domesticus). Anim Reprod Sci，2013，140：216-223.

[11] 李煌，李松，吳拓江，等.周期性單軸壓應力下大鼠髁突軟骨細胞早期應答機制的蛋白質組學初探.中華口腔醫(yī)學雜志，2007，9：263-271.