磷霉素鈣口服制劑有關(guān)物質(zhì)測定方法的建立

劉雪峰，樊寶娟，王小亮，曾愛國，常 春，傅 強*(.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 7006；.陜西省食品藥品檢驗所，西安 70065)

磷霉素最早是由西班牙CEPA公司的Hendin等從費氏鏈霉菌發(fā)酵液中分離得到的一種廣譜抗生素。本品的抗菌譜較廣，對大多數(shù)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有一定的抗菌作用[1-4]。臨床上主要用于腸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、皮膚科及軟組織感染及呼吸道感染等。常用的口服制劑為磷霉素鈣片、磷霉素鈣膠囊和磷霉素鈣顆粒。

《中國藥典》2010年版二部未對磷霉素鈣口服制劑中的雜質(zhì)進(jìn)行控制，僅在磷霉素鈣原料中采用滴定方法對磷霉素二醇物進(jìn)行控制[5]，而對其有關(guān)物質(zhì)的檢查，采用專屬性較強的方法很少見報道。本文建立了HPLC-ELSD方法對磷霉素鈣口服制劑中雜質(zhì)進(jìn)行控制，并對磷霉素二醇物進(jìn)行了LC/MS定性，采用自身對照方法進(jìn)行定量，所建立的方法專屬性強，準(zhǔn)確無干擾，為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量提供了有效的檢測方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Alliance HT型高效液相色譜儀，Attoch 3300蒸發(fā)光檢測器，Empower工作軟件；賽多利斯BP211D型電子分析天平，精度為0.01 mg。

1.2試藥 樣品：磷霉素鈣片(不同生產(chǎn)企業(yè)提供的樣品共11批)；磷霉素鈣膠囊(不同生產(chǎn)企業(yè)提供的樣品共34批)；磷霉素鈣顆粒(不同生產(chǎn)企業(yè)提供的樣品共6批)；磷霉素鈣對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號0351-200001)；甲醇、乙腈為色譜純，購自Merck公司；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱采用Apllo C18(250 mm×4.60 mm，5 μm)；以5 mmol·L-1正辛胺(用醋酸調(diào)pH4.8)-乙腈(90∶10)為流動相；流速為0.8 mL·min-1；用蒸發(fā)光檢測器檢測(參考條件:漂移管溫度60 ℃；載氣流速為2.0 L·min-1)。理論板數(shù)按磷霉素峰計算應(yīng)不低于2 000。磷霉素主峰與其相鄰的雜質(zhì)峰分離度應(yīng)不低于2.0。

2.2系統(tǒng)適用性溶液制備 取磷霉素鈣對照品適量，用5 mmol·L-1正辛胺溶液(用醋酸調(diào)pH3.5)制成1 mL約含磷霉素1 mg的溶液，水浴90 ℃加熱10 min，放冷至室溫，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，色譜圖中磷霉素主峰面積與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)不小于2.0。見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖

2.3供試品溶液制備 取裝量或質(zhì)量差異項下的供試品，研細(xì)，精密稱取適量，用水制成1 mL約含磷霉素1 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.4自身對照溶液制備 取上述磷霉素供試品溶液，加水制成1 mL約含磷霉素25，50和100 μg的溶液，作為對照品溶液(1)，(2)和(3)。

2.5測定方法 精密吸取空白溶液、系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液和對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，按自身對照外標(biāo)法以峰面積的對數(shù)與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系計算雜質(zhì)含量。不同劑型檢測結(jié)果見圖2。

2.6溶液穩(wěn)定性實驗 取磷霉素鈣對照品適量，用水制成1 mL約含磷霉素25，50和100 μg的溶液，分別測定其室溫放置0，0.5，1，2，4，8和12 h的主峰峰面積，其RSD分別為1.22%，0.94%和0.91%。說明樣品溶液在12 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

圖2 不同劑型有關(guān)物質(zhì)色譜圖

3 方法學(xué)考察

3.1破壞性實驗

3.1.1水溶液中高溫破壞性實驗 精密稱取磷霉素鈣原料藥適量，加水制成1 mL約含磷霉素1 mg的溶液，作為供試品溶液。將供試品溶液于90 ℃水浴中分別加熱1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12 h；分別取對照品溶液(1)，(2)和(3)和供試品溶液各時間段破壞的溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，供試品溶液色譜圖中如有降解產(chǎn)物，降解產(chǎn)物峰面積和對照品溶液色譜峰面積按外標(biāo)法峰面積的對數(shù)與質(zhì)量濃度成正比關(guān)系計算含量。結(jié)果見表1。

3.1.2強酸溶液中高溫破壞性實驗 精密稱取磷霉素鈣原料藥適量，用5 mmol·L-1正辛胺溶液(用醋酸調(diào)pH3.5)制成1 mL約含磷霉素1 mg的溶液，作為供試品溶液。將供試品溶液于90 ℃水浴中分別加熱1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12 h；分別取對照品溶液(1)，(2)和(3)和供試品溶液各時間段破壞的溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，供試品溶液色譜圖中如有降解產(chǎn)物，降解產(chǎn)物峰面積和對照品溶液色譜峰面積按外標(biāo)法峰面積的對數(shù)與質(zhì)量濃度成正比關(guān)系計算含量。結(jié)果見表1。

3.1.3強堿溶液中破壞性實驗 精密稱取磷霉素鈣原料藥適量，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液制成1 mL約含磷霉素1 mg的溶液，作為供試品溶液。將供試品溶液于60 ℃水浴中分別加熱1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12 h；分別取對照品溶液(1)，(2)和(3)和供試品溶液各時間段破壞的溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，供試品溶液色譜圖中如有降解產(chǎn)物，降解產(chǎn)物峰面積和對照品溶液色譜峰面積按外標(biāo)法峰面積的對數(shù)與質(zhì)量濃度成正比關(guān)系計算含量。結(jié)果見表1。

3.2檢出限和定量限 將磷霉素鈣對照品水溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后制得一系列不同質(zhì)量濃度的溶液，進(jìn)行分析，以S/N=3作為檢測限，S/N=10作為定量限，結(jié)果磷霉素鈣檢測限為6.82 ng，定量限為10.23 ng。

3.3線性關(guān)系考察 取磷霉素鈣對照品適量，加水制成1 mL約含磷霉素20.2，40.4，60.6，80.8和 121.2 μg的溶液，分別取10 μL，注入高效液相色譜儀中，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果回歸方程：Y=47.686X+0.226 4，r=0.999 2。

3.4加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的磷霉素鈣膠囊、磷霉素鈣片和磷霉素鈣顆粒各9份(約相當(dāng)于磷霉素7.5 mg)，分別精密加入磷霉素對照品約4.5，7.5和10.5 mg，置于100 mL量瓶中，加水適量超聲溶解并稀釋到刻度，搖勻，制成相對含量分別為80%，100%和120%的溶液各3份，分別取10 μL，注入高效液相色譜儀中，計算回收率，結(jié)果磷霉素鈣膠囊平均回收率為98.7%，RSD為0.98%，磷霉素鈣片平均回收率為96.8%，RSD為1.14%，磷霉素鈣顆粒平均回收率為93.6%，RSD為1.65%。

表1 不同時間破壞性實驗結(jié)果

3.5精密度實驗 取磷霉素鈣對照品適量，用水制成1 mL約含磷霉素25，50和100 μg的溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測定色譜主峰峰面積，其RSD分別為0.89%，0.57%和0.36%。

3.6專屬性實驗 取磷霉素鈣系統(tǒng)適用性溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，收集主峰相對保留時間0.73處的雜質(zhì)注入質(zhì)譜檢測器中[6]，結(jié)果其m/z153.9，判斷其結(jié)構(gòu)為磷霉素二醇物。其一階質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 磷霉素鈣系統(tǒng)適用性溶液降解產(chǎn)物一階質(zhì)譜圖

4 樣品的測定

對全國磷霉素鈣片、磷霉素鈣膠囊以及磷霉素鈣顆粒共計51批次樣品進(jìn)行了測定，結(jié)果均檢出磷霉素二醇物，其中磷霉素鈣片中磷霉素二醇物含量為0.95%～4.25%，磷霉素鈣膠囊中磷霉素二醇物含量為0.45%～1.33%，磷霉素鈣顆粒中磷霉素二醇物含量為1.91%～4.52%。

5 結(jié)果與討論

磷霉素鈣的水溶液和pH 3.5的5 mmol·L-1的正辛胺溶液在高溫下都會降解，同時，降解產(chǎn)物的量隨著時間的變化而變化。其中磷霉素鈣的pH 3.5的5 mmol·L-1的正辛胺溶液在高溫破壞下，降解產(chǎn)物的量隨著時間的增長而增大，在4 h內(nèi)，降解速率較大，之后隨著加熱破壞時間的增長，降解物的量逐漸緩慢增大。

由于不同的蒸發(fā)光檢測器其溫度和氣體流速不盡相同，因此應(yīng)根據(jù)不同品牌的蒸發(fā)光檢測器進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，以滿足檢測條件。

本文采用HPLC-ELSD方法所建立的色譜條件，不僅可以測定磷霉素鈣及其口服制劑有關(guān)物質(zhì)的含量，而且對其測定含量具有很好的指導(dǎo)意義。該方法檢測靈敏度高，分析時間短，分離效果好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可有效地控制磷霉素鈣及其制劑的質(zhì)量。

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