張悅君,曾麗璇,康 園,張秋云
(華南師范大學化學與環(huán)境學院;教育部環(huán)境理論化學重點實驗室,廣州510006)
作為一種重要的有機化工原料,雙酚A(bisphenol A,BPA)被廣泛應用于塑料增塑劑、聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂、抗氧化劑、農(nóng)藥、化妝品等生產(chǎn)中.日常生活中的塑料容器、食品包裝材料、容器內壁涂料上均可降解出BPA[1-2].近年來針對BPA開展了廣泛的研究,均采用魚類、水蚤和海洋貝類作為指示生物進行研究[3-4],關于BPA對雙殼貝類的毒性研究相對較少.河蜆(Corbicula fluminea)是一種主要棲息于淡水及咸淡水中的常見雙殼類,為河流中重要底棲動物.作為江河水庫等淡水生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢種,影響著當?shù)厮鷳B(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)[5].由于河蜆具有分布廣泛、個體較大、生活史較長、遷移性小、不主動攝取食物、容易采集等特點,同時作為一種濾食性的動物,以水中的浮游生物(如硅藻、綠藻、原生動物、輪蟲等)為食料[6],在食物鏈中具有重要作用,對毒物有很高的濃縮系數(shù),能直接反映水體的污染狀況,因此河蜆被認為是水生生態(tài)毒理學上目標污染物低劑量長期作用下的毒性效應的指示生物[7].國內BPA對河蜆的生態(tài)毒理研究尚處于起步階段.
由于環(huán)境水體中BPA含量較低,而低濃度污染物對生物的危害在短期內難以察覺[8],動物耗氧率(Oxygen Consumption Rate,OCR)和排氨率(Ammonia Excretory Rate,AER)的變化可作為反映某些污染物毒性大小的敏感指標[9].同時超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)等抗氧化酶是生物體內保護系統(tǒng)的主要酶,其活性可作為生物逆境生理和衰老生理指標[10].本文采用靜態(tài)染毒法,研究BPA急性暴露及亞急性暴露對河蜆呼吸代謝及抗氧化酶活性的影響,探討B(tài)PA對河蜆的毒性效應,為防治BPA污染提供依據(jù).
BSA1245S-CW電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);UV-3100PC紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司);玻璃勻漿器.
雙酚A(分析純);乙醇(分析純).
試驗所用河蜆來自珠江三角洲河網(wǎng)中水質較好的增江.選取殼長(25.0 ±2.0)mm,殼高(19.40 ±0.20)mm,體質量為(4.00 ±0.40)g 的健康河蜆用于試驗.用經(jīng)過3天自然脫氯和已充分曝氣的自來水將河蜆在試驗室暫養(yǎng)1周,暫養(yǎng)期間水溫為(20±1)℃,自然光照.
1.3.1 急性毒性試驗 急性毒性采用半靜態(tài)換水式試驗,每24 h更換1次試驗液,換水后加入BPA至初始質量濃度.試驗容器為定制的容積為1 L的玻璃水族箱,每升水中放10只河蜆,試驗期間不喂食,試驗條件控制在水溫(20±1)℃,pH值7.5~8.0,溶解氧7~8 mg/L.預試驗設置3個間隔較大的質量濃度梯度,每組設3個平行,求出48 h的100%死亡、無死亡和大致半致死質量濃度.正式試驗按照預試驗所得結果以等對數(shù)間距設置5個試驗質量濃度組(5、7、10、14、20 mg/L)和 1 個空白對照組、1個溶劑對照組(體積分數(shù)0.1%的乙醇,下同),每組設3個平行試驗.試驗期間連續(xù)觀察受試對象的活動情況,及時清除死亡的河蜆和代謝物,每隔24 h記錄河蜆的死亡情況.個體死亡的判斷標準:河蜆外膜收縮、刺激時腹足不能收縮、雙殼張開,多次用鑷子適度敲擊殼體并夾緊雙殼而沒有自動閉殼反應.暴露96 h后計算其半致死濃度(median lethal concentration,LC50).然后按下式計算安全濃度(SC):SC=96 h LC50×0.01.
1.3.2 亞急性毒性試驗 亞急性毒性試驗的質量濃度設置參考了急性毒性試驗所得的數(shù)據(jù)結果,以96 h-LC50的1/10、1/8、1/4和 1/2設置4個質量濃度組,另設1個溶劑對照組(0.1%乙醇),每組設3個平行,對河蜆進行亞急性染毒試驗,試驗采用半靜態(tài)換水,暴露期間的實驗方法與96 h-LC50急性毒性試驗相同,每天觀察記錄河蜆的死亡情況,及時清除死亡的河蜆和代謝物.
1.3.3 耗氧率和排氨率的測定 采用劉其根[11]等的方法進行測定.根據(jù)試驗前后代謝瓶內水中的溶解氧及氨氮含量,按下列公式計算河蜆的耗氧率和排氨率:
式中:OR為單位體質量耗氧率(mg·g-1·h-1);DO0和DOt為試驗開始、在t時間結束時水中DO的含量(mg/L);V為代謝瓶中水的體積(L);W為河蜆質量(g);t為試驗持續(xù)時間(h).
式中:NR為單位河蜆個體質量排氨率(mg·g-1·h-1);N0和Nt為試驗開始、在t時間結束時水中NH3-N的質量濃度(mg/L);V為代謝瓶中水的體積(L);W為河蜆質量(g);t為試驗持續(xù)時間(h).
1.3.4 酶活性的測定 亞急性毒性試驗結束后,從各組中各取出數(shù)只河蜆盡快剖開,用濾紙對其吸干水分后,稱取軟體組織0.50 g用6.7×10-3mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)3.0 mL進行勻漿,勻漿液倒入離心管中,加3 mL磷酸鹽緩沖溶液沖洗勻漿器后,也倒入離心管中,在4 000 r/min離心30 min,取上清液為粗酶液.
(1)SOD活性測定 采用鄒國林[12]改進的鄰苯三酚自氧化法,波長λ=325 nm.SOD酶活性單位定義為:每毫升反應液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量定義為一個酶活性單位.
(2)CAT活性測定 采用徐鏡波等[13]的紫外分光光度法進行測定,波長λ=240 nm.CAT酶活性定義為:一個過氧化酶單位相當于在規(guī)定條件下,于25℃、pH 7.0,每分鐘分解1μmol過氧化氫所需的酶量.
(3)總蛋白含量的測定 采用Bradford法[14],即考馬斯亮藍法.10.00 mL Bradford染色液加入0.30 mL待測蛋白,混勻后在595 nm處檢測吸光度.以牛血清白蛋白(BSA)為標準蛋白做出的標準曲線計算各樣本蛋白含量.
試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析,用PROBIT模型計算LC50及其95%置信區(qū)間(95%C.I.);文中描述性統(tǒng)計值以3次平均數(shù)±標準偏差(mean±SD)表示,組間數(shù)據(jù)采用T檢驗法進行分析,得出顯著性差異的相關信息,P<0.05認為存在顯著性差異,P<0.01認為存在極顯著差異.
急性毒性試驗結束后,空白對照組以及BPA溶劑對照組均無死亡.觀察發(fā)現(xiàn),試驗期間未死亡個體的活動能力下降,用鑷子適度敲擊河蜆殼體時,其閉殼速度緩慢,用玻璃棒刺激河蜆的腹足時,其收縮速度緩慢,其外套膜邊緣有黏性絮狀物包被.
在同一試驗質量濃度組中,隨著暴露時間的延長河蜆死亡率均呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(表1).表示化學物質對生物的生態(tài)毒理學危害性可根據(jù)其LC50分為4個等級[15]:≤1 mg/L為極高;1~10 mg/L為高毒;10~100 mg/L為中毒;>100 mg/L為低毒.參照分級標準,BPA對河蜆的毒性為高毒.
表1 BPA對河蜆的急性LC50值Table 1 LC50 value of Asian clam for BPA
目前,已有許多學者關注BPA對水生生物的半致死濃度.
比較表1和表2可以看出,河蜆對BPA的耐受性遠高于鯉魚,與泥鰍、水螅、斑馬魚和雌性日本青鳉較為接近,由此得出不同水生生物對BPA的耐受性差異較大,可能與不同水生生物的呼吸渠道以及代謝解毒能力的差異相關,其中泥鰍除腮之外還可用皮膚呼吸,而魚鰓是污染物發(fā)揮毒性作用的靶器官之一,因此,與鯉魚、斑馬魚相比泥鰍對BPA的耐受性更強[18];而河蜆作為雙殼貝類生物,具有堅硬的外殼保護,能有效減少身體與污染物的接觸,從而降低污染物的毒性損害[21],但同時河蜆作為活動力差的貝類品種,因無回避能力,暴污程度較大,故其對BPA的耐受性介于不同水生生物之間.
表2 BPA對水生生物的急性LC50值Table 2 LC50 value of aquatic organisms for BPA
根據(jù)急性毒性試驗結果(表1)BPA對河蜆的96 h-LC50為6.34 mg/L,以 BPA 對河蜆的 96 h-LC50的1/10、1/8、1/4和1/2設置4個質量濃度組,即0.63、0.79、1.59、3.17 mg/L.7 d 的亞急性毒性試驗結束后,對照組均無死亡,其他濃度組死亡率均低于5%.
2.2.1 BPA對河蜆呼吸代謝的影響 在BPA暴露下,河蜆耗氧率和排氨率隨著暴露質量濃度的升高(表3),耗氧率和排氨率先降低后升高再降低,各暴露質量濃度組中的耗氧率和排氨率均低于溶劑對照組.在低質量濃度暴露下(0~0.79 mg/L),河蜆耗氧率和排氨率表現(xiàn)為受到抑制,其中在0.63 mg/L時耗氧率和排氨率均受到顯著抑制(P<0.05),而在0.79 mg/L時,耗氧率和排氨率均受到極顯著抑制(P<0.01);隨著BPA暴露質量濃度的升高(0.79~1.59 mg/L),河蜆耗氧率和排氨率呈升高趨勢,但仍顯著低于溶劑對照組(P<0.05);而隨著暴露質量濃度的繼續(xù)升高(1.59~3.17 mg/L),耗氧率和排氨率再次降低表現(xiàn)為受到極顯著抑制(P<0.01).
表3 BPA對河蜆呼吸代謝和抗氧化酶活性的影響Table 3 Effect of BPA on respiratorymetabolism and antioxidant enzymes of Asian clam
2.2.2 BPA對河蜆抗氧化酶活性的影響 在BPA暴露下,河蜆軟體組織SOD和CAT活性隨著暴露質量濃度的升高也有顯著的變化(表3),總體趨勢為隨著BPA質量濃度的升高SOD和CAT活性先降低后升高再降低,其中各質量濃度組中CAT活性均低于溶劑對照組.在低質量濃度暴露下(0~0.79 mg/L),河蜆 SOD和 CAT活性受到一定抑制,在0.63 mg/L時SOD和CAT活性均受到輕微抑制,在0.79 mg/L時,SOD和CAT活性均受到極顯著抑制(P<0.01);隨著BPA暴露質量濃度的升高,河蜆SOD和CAT活性呈升高趨勢,其中在1.59 mg/L時,SOD的活性受到顯著誘導(P<0.05),而 CAT仍極顯著低于溶劑對照組(P<0.01);隨著暴露質量濃度的繼續(xù)升高(1.59 ~3.17 mg/L),SOD 和CAT活性再次降低表現(xiàn)為受到極顯著抑制(P<0.01).
在BPA較低暴露質量濃度下,河蜆的耗氧率和排氨率、SOD和CAT活性有所降低,其中在0.63 mg/L時均無極顯著性的變化,直至0.79 mg/L時其耗氧率和排氨率以及2種酶活性才受到極顯著性的抑制,隨著質量濃度的繼續(xù)升高,河蜆耗氧率和排氨率、2種酶活性相對均有所升高,而在濃度極高時其耗氧率和排氨率以及2種酶活性才又受到極顯著性的抑制,表明此時BPA對河蜆抗氧化酶系統(tǒng)和呼吸代謝能力產(chǎn)生了一定的毒性效應.
BPA對河蜆的96 h-LC50為6.34 mg/L;在試驗質量濃度范圍內,河蜆耗氧率和排氨率、SOD、CAT活性隨暴露質量濃度升高均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢,表明BPA可對河蜆產(chǎn)生明顯的氧化脅迫和毒性效應.
總體而言,在本試驗中,河蜆耗氧率和排氨率以及2種酶活性指標對BPA較敏感,且均呈現(xiàn)出較好的一致性和規(guī)律性,至于這些呼吸代謝以及抗氧化酶內在的變化機理,這將是下一步在分子水平上的研究重點.
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