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    壯腰健身丸UPLC 指紋圖譜及化學模式識別

    2021-02-14 10:58:14喻何云任琦丁銀平趙敏敏付輝政游媛
    藥品評價 2021年23期
    關鍵詞:號峰女貞指紋

    喻何云,任琦,丁銀平,趙敏敏,2,付輝政,游媛

    1.江西省藥品檢驗檢測研究院,國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室,江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心,江西 南昌 330029;2.江西中醫(yī)藥大學,江西 南昌 330004

    壯腰健身丸由女貞子(酒蒸)、金櫻子、千斤拔、黃精、狗脊、熟地黃、制何首烏七味藥材組成,具有壯腰健身的功效,臨床上廣泛用于腰腿酸軟,心悸眼花,耳鳴頭暈,陽萎遺精等治療[1]。壯腰健身丸現(xiàn)行標準收載于《中國藥典》2020 版一部。目前,其質量控制研究停留在HPLC 法測定特女貞苷單一成分的含量,檢測指標少,難以有效控制壯腰健身丸的整體質量。由于壯腰健身丸成分復雜多樣性,臨床用藥時需各成分相互協(xié)同才能達到治療效果,但現(xiàn)行標準難以控制產(chǎn)品質量,無法保證產(chǎn)品工藝的穩(wěn)定性與均一性。目前針對其質量分析,僅有壯腰健身丸質量標準研究[2]及微波消解-電感耦合等離子體質譜法測定壯腰健身丸中的重金屬及有害元素[3]的報道,未見國內(nèi)外有關壯腰健身丸指紋圖譜的研究報道。

    中藥指紋圖譜[4-6]能夠反應中藥活性成分整體特性,具有分析速度快、專屬性強、重現(xiàn)性好等特點。化學模式識別[7-9]能夠將指紋圖譜的多維信息進行處理、綜合分析評估,全面客觀地反映中藥的整體信息,對其質量控制及質量評價研究起到重要的作用。故本研究建立了壯腰健身丸UPLC 指紋圖譜,同時進行相似度評價,并結合聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘-判別分析3 種化學模式識別分析方法對其進行質量評價研究[10-18],旨在為全面控制及評價壯腰健身丸提供參考依據(jù)。

    1 材料

    1.1 儀器

    Agilent 1290 Infinity(DAD)型超高效液相色譜儀(美國Agilent 科技有限公司);Milli-Q Direct 16 超純水儀(德國Millipore 中國有限公司);Sartorius BT 25 S 型十萬分之一天平(德國Sartorius 公司);Sartorius BSA 124S-CW 型萬分之一天平(德國Sartorius 公司)。

    1.2 試藥

    紅景天苷(批號:110818-200404);2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(批號:110844-201109);特女貞苷(批號:111926-201102);染料木素(批號:111704-201703);大黃素(批號:110756-201512);大黃素甲醚(批號:110758-201616),以上均購自中國食品藥品檢定研究院。女貞子(酒蒸)、黃精、熟地黃、金櫻子、狗脊、制何首烏、千斤拔七味藥材均由江西九華藥業(yè)有限公司提供,經(jīng)江西省藥品檢驗檢測研究院付輝政主任鑒定為正品。甲醇、乙腈為色譜純,水為超純水,其他為分析純。11 批壯腰健身丸分別來自江西九華藥業(yè)有限公司(批號:190101、190102、190301、160102、160302、160603、180701、180702、180901、180902)、江西半邊天藥業(yè)有限公司(批號:20160701)。

    2 方法與結果

    2.1 色譜條件

    色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3(1.8 μm,100 mm×2.1 mm);流動相為甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B),進行梯度洗脫(0~20 min,5%~90% A;20~25 min,90% A);檢測波長為波長轉換(0~4.1 min,320 nm;4.1~4.8 min,254 nm;4.8~7.0 min,224 nm;7.0~11.0 min,320 nm;11.0~16.0 min,254 nm;16.0~19.0 min,320 nm;19.0~25.0 min,288 nm);柱溫為40 ℃;流速為0.2 mL/min。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 對照品溶液的制備 取紅景天苷對照品、2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品、特女貞苷對照品、大黃素對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL 各含紅景天苷15 μg、2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷12 μg、特女貞苷60 μg、大黃素7 μg的混合溶液,搖勻,即得。

    2.2.2 供試品溶液的制備 取本品,剪碎,混勻,取約2 g,精密稱定,精密加80%甲醇50 mL,置具塞錐形瓶中,稱定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

    2.2.3 單味藥材溶液的制備 取女貞子(酒蒸)、黃精、熟地黃、金櫻子、狗脊、制何首烏、千斤拔七味藥材,按“2.2.2”項下方法制備,即得。

    2.3 方法學考察

    2.3.1 精密度試驗 取樣品(批號:180901),按“2.2.2”項下方法制備,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次,測定,記錄各色譜峰保留時間和積分峰面積。以8 號色譜峰(特女貞苷)為參照峰(S),計算各色譜峰的相對保留時間RSD<1.00%,相對峰面積RSD<5.00%,圖譜相互間相似度均大于0.90,表明儀器精密度良好。

    2.3.2 重復性試驗 取樣品(批號:180901)6 份,按“2.2.2”項下方法制備,按“2.1”項下色譜條件測定,記錄各色譜峰保留時間和峰面積。以8 號色譜峰(特女貞苷)為參照峰(S),計算各色譜峰的相對保留時間RSD<1.00%,相對峰面積RSD<5.00%,圖譜相互間相似度均大于0.90,表明該方法重復性良好。

    2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取樣品(批號:180901)1 份,按“2.2.2”項下方法制備,按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 測定指紋圖譜,記錄各色譜峰保留時間和峰面積。以8 號色譜峰(特女貞苷)為參照峰(S),計算各色譜峰的相對保留時間RSD<1.00%,相對峰面積RSD<5.00%,圖譜相互間相似度均大于0.90,表明該供試品溶液至少在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

    2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價

    2.4.1 指紋圖譜的建立 取11 批壯腰健身丸樣品溶液,按“2.1”項下色譜條件測定,記錄。將得到的數(shù)據(jù)導入2012 版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”,選取“時間窗寬度”為0.10 min,對照圖譜的生成方法為“中位數(shù)”,自動匹配后,得到對照圖譜,見圖1,共確定15 個共有峰。

    圖1 壯腰健身丸的對照指紋圖譜

    2.4.2 共有峰的指認、歸屬及參照峰的選擇 取“2.2”項下的制備的3 種溶液,分別按“2.1”項下色譜條件測定,結果見圖2。采用對照品保留時間及紫外光譜圖指認出6 個特征峰,分別是4 號峰紅景天苷,6 號峰2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷,8 號峰特女貞苷,12 號峰染料木素,13 號峰大黃素,15 號峰大黃素甲醚。將供試品與藥材色譜圖進行對比,歸屬了15 個共有峰,女貞子(酒蒸)提供了4、5、7、8、10 號峰;金櫻子提供了9 號峰;千斤拔提供了12、14 號峰;黃精提供了1 號峰;熟地黃提供了1、2、3、11 號峰;制何首烏提供了6、13、15 號峰。其中8 號峰為女貞子(酒蒸)的特征成分,該峰保留時間適中、吸收強、分離度好,故將其作為參照峰,見圖2。

    圖2 色譜峰指認及歸屬

    2.4.3 相似度評價 將11 批壯腰健身丸的數(shù)據(jù)導入2012 版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”,計算樣品與對照指紋圖譜之間的相似度,結果分別為1.000、0.999、0.994、0.811、0.837、0.803、0.855、0.851、0.936、0.906、0.720。結果表明,11 批次樣品相似度有4 批次樣品低于0.850。

    2.5 化學模式識別

    2.5.1 聚類分析(CA)將11 批壯腰健身丸樣品的15 個共有峰的峰面積相對于稱樣量量化后進行標準化處理,組成11×15 階原始矩陣,運用IBM SPSS Statistics 23.0 軟件,以組間聯(lián)接為聚類方法,測量度采用平方歐氏距離,進行系統(tǒng)聚類分析,CA 樹狀圖見圖3。結果顯示,當歐氏距離為10 時,11批樣品可分為3 類:Ⅰ類:S1~S3,相似度均大于0.990;Ⅱ類:S4~S10 相似度均大于0.800;Ⅲ類:S11。此結果與相似度評價結果一致。

    圖3 11批壯腰健身丸聚類分析結果

    2.5.2 主成分分析(PCA)用IBM SPSS Statistics 23.0軟件對量化的各共有峰峰面積進行標準化處理后,對11 批壯腰健身丸進行主成分分析,計算相關系數(shù)矩陣的特征值及其方差貢獻率。提取3 個主成分(特征值>1),其累計方差貢獻率為89.915%,可代表指紋圖譜共有峰的大部分信息。利用SIMCA 14.1軟件繪制主成分散點得分圖,見圖4。結果顯示11批壯腰健身丸可分為3 類,與聚類分析結果一致。

    圖4 11批壯腰健身丸主成分分析散點得分圖

    2.5.3 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)為進一步篩選出貢獻較大的成分,本研究在主成分分析的基礎上,采用SIMCA 14.1 軟件建立OPLS-DA 模型,結果X 矩陣結實率參數(shù)R2X 為0.843,模型穩(wěn)定性參數(shù)R2Y 為1,模型預測能力參數(shù)Q2為0.869,均大于0.5,且R2和Q2兩者差距均小于0.2,說明所建模型解釋率、穩(wěn)定性和預測性均較強。經(jīng)OPLS-DA 模型擬合分析,得到11 批供試品的得分散點圖,見圖5。為驗證所建OPLS-DA 模型是否存在過度擬合,將分類矩陣變量參數(shù)設定隨機排列200 次做置換檢驗,見圖6。結果R2和Q2擬合線在Y 坐標軸的截距分別為0.129(應小于0.3)和-0.761(應小于0.05),表明該模型不存在過度擬合現(xiàn)象,結果可靠。

    圖5 11批壯腰健身丸OPLS-DA得分圖

    圖6 11批壯腰健身丸OPLS-DA置換檢驗圖

    VIP 圖可直觀體現(xiàn)影響樣品組間差異的差異性成分,VIP>1 即為質量差異標志性成分,見圖7。結果峰6(2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-Oβ-D-葡萄糖苷)、峰3、峰2、峰8(特女貞苷)的VIP 值均大于1,為壯腰健身丸的質量差異標志性成分。建議企業(yè)在生產(chǎn)過程中,應著重關注這些成分,并建立相應的質量控制體系,以提高產(chǎn)品的均一性及穩(wěn)定性。

    圖7 11批壯腰健身丸OPLS-DA VIP 圖

    3 討論

    3.1 色譜條件的考察

    本實驗分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%醋酸溶液、乙腈-水不同比例梯度洗脫流動相系統(tǒng),不同流速(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL/min),不同柱溫(25、30、35、40、45 ℃),不同進樣量(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL)對分析結果的影響。綜合分離效果、色譜峰的峰形,采用甲醇-0.1%甲酸溶液梯度洗脫、0.2 mL/min 流速、40 ℃柱溫、2.0 μL 進樣量的色譜條件作為壯腰健身丸指紋圖譜分析條件。

    3.2 結果分析

    指紋圖譜相似度評價結果表明,11 批次樣品相似度有4 批次樣品低于0.85,說明不同生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)工藝差異性較大,且同一生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的樣品間差異性也較大。分析原因可能與工藝(粉碎程度及消毒方式)、原藥材(質量優(yōu)劣)、投料(少投料)等因素有關。本試驗采用了CA、PCA 及OPLS-DA 3 種化學識別模式分析方法,將樣品分成了3 類,并篩選到了4 個質量差異標志性成分,分別為峰6(2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)、峰3、峰2、峰8(特女貞苷)。通過單味藥材對照實驗,最終確定6 號峰來自制何首烏,3號峰及2 號峰均來自熟地黃,8 號峰來自女貞子(酒蒸)。提示生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)制備過程中應重點關注上述4 個成分的含量變化以及原藥材制何首烏、熟地黃、女貞子(酒蒸)的質量優(yōu)劣情況。

    4 結論

    本試驗建立了壯腰健身丸UPLC 指紋圖譜,并結合CA、PCA 及OPLS-DA 化學模式識別技術對其質量進行綜合評價,該分析方法專屬性強、重現(xiàn)性好、分析速度快,為科學、有效、快速地控制及評價壯腰健身丸質量提供參考依據(jù)。

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