蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究概述

邱望仁 鄒國英 查娟娟 霍立田

(景德鎮(zhèn)陶瓷學(xué)院信息工程學(xué)院，江西 景德鎮(zhèn) 333403)

0 引言

在整個生物發(fā)展過程中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾可以協(xié)調(diào)并控制絕大多數(shù)蛋白的活躍程度，正是因為有蛋白質(zhì)翻譯后修飾，使得一個基因并非只對應(yīng)一個蛋白質(zhì)，從而賦予了人類生命過程更多的復(fù)雜性。因此對這一過程的蛋白進行注解變得不容或缺。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和對疾病機理的研究中，熟知人類在各階段的生長發(fā)育期及心理、病理發(fā)生改變的原因和情況對研究各類基因進行細(xì)胞表達(dá)所具有特征擁有特別意義。對這一方面的探究或許能發(fā)現(xiàn)與存在特殊的心理及病理狀態(tài)有聯(lián)系的分子，而這些分子為將來構(gòu)思針對于特定靶分子的藥用蛋白打下了良好根基。因此，了解蛋白翻譯后修飾的原理、種類及作用對防患重大癌癥有特殊功效。

1 常見的翻譯后修飾的類型及生物功能

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾進程具有繁雜性及多樣性，現(xiàn)今在對真核生物的探究中，就發(fā)現(xiàn)了20多種不同的修飾范例。在目前的探究發(fā)現(xiàn)，比較常用的類別就有甲基化、乙?；?、糖基化、磷酸化、酯基化以及近年發(fā)現(xiàn)的泛素化與SUMO化這七種［1］。

1.1 甲基化

甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過程?？尚纬筛鞣N甲基化合物，或是對某些蛋白質(zhì)或核酸等進行化學(xué)修飾形成甲基化產(chǎn)物。甲基化是蛋白質(zhì)和核酸的一種重要的翻譯修飾，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和關(guān)閉，與癌癥、衰老、老年癡呆等許多疾病密切相關(guān)，是表觀遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容之一。最常見的甲基化修飾有DNA甲基化和組蛋白甲基化［2］。

1.2 乙?；?/h3>

乙酰化其主要講把一種乙酰官能基團添加到另一種有機化合物上，并進行結(jié)合的過程。

蛋白質(zhì)中的賴氨酸乙?；揎椪{(diào)控蛋白質(zhì)的多種性質(zhì)，包括DNA-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄活性等［3］。除了這些重要的生物學(xué)功能以外，賴氨酸乙?；鞍踪|(zhì)及其調(diào)控酶與衰老及幾種重大疾病(如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)變形紊亂等)緊密相關(guān)。最近，Kim Orth及其同事在研究耶爾森菌屬的效應(yīng)因子YopJ(一個細(xì)菌毒力因子)時，發(fā)現(xiàn)在真核生物中存在著一種重要的翻譯后修飾形式:絲氨酸和蘇氨酸的乙?；揎棥＝z氨酸和蘇氨酸的磷酸化和O-糖基化修飾可以導(dǎo)致細(xì)胞信號傳導(dǎo)機制的重大改變，Kim Orth及其同事發(fā)現(xiàn)在YopJ中，絲氨酸和蘇氨酸的乙酰化修飾與這些氨基酸的磷酸化修飾相互競爭，從而改變細(xì)胞的信號通路機制。

1.3 糖基化

糖基化的過程主要是在糖基轉(zhuǎn)移酶的幫助下，使低聚糖以糖苷的方式移動到蛋白質(zhì)分子上，并與蛋白質(zhì)分子上特定的氨基酸殘基進行共價結(jié)合作用而構(gòu)成糖苷鍵的經(jīng)過。蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化反應(yīng)，從而有糖蛋白這種物質(zhì)的產(chǎn)生，此過程一般在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上發(fā)生，并且糖基化擁有很多功效，主要是對調(diào)控蛋白質(zhì)發(fā)生修飾和改善蛋白質(zhì)的生物作用［4］。

1.4 磷酸化

蛋白質(zhì)磷酸化指由蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP或GTPγ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基(絲氨酸、蘇氨酸)上的過程，是生物體內(nèi)一種普通的調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起重要作用。蛋白質(zhì)進行磷酸化是所有生物中進行的最廣泛、最獨特，并且亦是最具效率的一類蛋白質(zhì)翻譯后修飾進程。在生物體中，進行磷脂化修飾的蛋白只有三分之一，別看這個數(shù)目小，但其實相對其他修飾而言其修飾是非常龐大的。并且研究發(fā)現(xiàn)，有幾百種磷酸激活酶已經(jīng)被人類基因翻譯及轉(zhuǎn)錄過［5］。其與多個生理有關(guān)，并和疾病的產(chǎn)生過程有一定的聯(lián)系，如:神經(jīng)的活躍、信號的傳導(dǎo)、細(xì)胞的生長發(fā)育、腫瘤癌的產(chǎn)生及肌肉頻繁萎縮等。

1.5 酯基化

蛋白質(zhì)酯基化的一般作用過程是利用氧和硫原子使脂鏈連接到蛋白物質(zhì)上，從而形成脂蛋白的綴合物，在這個進程中常會有蛋白分子內(nèi)所含的半胱氨酸發(fā)生法呢基烷基化，或者棕櫚?；阴；渥饔梦稽c通常是硫鍵。硫和氧原子被修飾的脂鏈能改變所結(jié)合蛋白的功能，因為這個蛋白中的生物磷脂膜能與脂鏈相互吸引并溶合，所以此蛋白會被牽制在細(xì)胞膜上不能動彈，其功能也就受到限制及改變。

由于具有脂鏈的蛋白能促使其在特定的細(xì)胞膜上進行固定，而且能夠調(diào)控此蛋白施展其有益及高效的生物作用［6］。最近幾年，有科學(xué)家證明，脂蛋白綴合物要想正常發(fā)揮其生物功能，必須首先被吸收到細(xì)胞膜上才可以，所以蛋白酯基化的作用是不容忽視的。

1.6 泛素化

泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分類，從中選出靶蛋白分子，并對靶蛋白進行特異性修飾的過程。蛋白質(zhì)泛素化作用是后翻譯修飾的一種常見形式，該過程能夠調(diào)節(jié)不同細(xì)胞途徑中各式各樣的蛋白質(zhì)泛素蛋白底物。泛素化在蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能、調(diào)節(jié)和降解中都起著十分重要的作用。同時，它也參與了細(xì)胞周期、增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳遞、損傷修復(fù)、炎癥免疫等幾乎一切生命活動的調(diào)控。泛素化與腫瘤、心血管等疾病的發(fā)病密切相關(guān)［7］。因此，作為近年來生物化學(xué)研究的一個重大成果，它已然成為研究、開發(fā)新藥物的新靶點。

1.7 SUMO化

SUMO(small ubiquitin—related modifier)分子結(jié)構(gòu)和SUMO化反應(yīng)途徑都與泛素相似，都參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾，SUMO化修飾與泛素化修飾二者的功能上完全不同。SUMO化修飾可參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、核轉(zhuǎn)運、維持基因組完整性與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種細(xì)胞內(nèi)活動，是一種重要的多功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。和泛素化不同的是SUMO化修飾不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解，但作用于不同底物會產(chǎn)生不一樣的影響，也就是說，SUMO化修飾的后效取決于它作用的底物［8］。但是它們都是一些重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白。SUMO生物功能表現(xiàn)在以下6個方面:(1)蛋白的亞細(xì)胞定位;(2)轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控;(3)蛋白穩(wěn)定性調(diào)節(jié);(4)細(xì)胞周期調(diào)控;(5)維持基因組完整性;(6)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控。

2 研究方法及關(guān)鍵技術(shù)

2.1 甲基化研究方法及關(guān)鍵技術(shù)

2.1.1 甲基化特異性的PCR

其基本原理是把所有的基因組DNA用亞硫酸氫鹽進行處理，如此做是因為尚未發(fā)生甲基化修飾的胞嘧啶都會被作用變?yōu)槟蜞奏?，但進行甲基化修飾的胞嘧啶則不會發(fā)生改變［9］。由上面的原理可知，采用不同種類的引物做PCR，即可檢測出這種微弱的變化，這樣就能確定基因是否存在甲基化。

2.1.2 亞硫酸氫鹽測序法

它是利用重亞硫酸鹽對DNA進行處理，此過程會使沒有進行甲基化的胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏?，但進行甲基化的基團則不會。然后把經(jīng)作用的物質(zhì)為基礎(chǔ)，加入甲基化特異性的物質(zhì)(primerI)或者非甲基化的物質(zhì)(primerII)，使其進行特異性的擴增［10］。

2.1.3 高分辨率熔解曲線法

在非CpG島位置設(shè)計一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化。

2.2 乙?；芯糠椒瓣P(guān)鍵技術(shù)

2.2.1 通過生物質(zhì)譜鑒定乙酰化修飾位點［11］

質(zhì)譜技術(shù)通過檢測到的肽段的質(zhì)量與預(yù)測的肽段的質(zhì)量進行對比，如果二者質(zhì)量相差42amu，則認(rèn)為在氨基酸殘基或在蛋白質(zhì)末端發(fā)生乙?；揎?。通過從鑒定到的肽段的N末端或C末端逐個分析得到的b離子或y離子，就可以確定發(fā)生乙酰化修飾的氨基酸位點。

2.2.2 基于特異性識別乙?；嚢彼釟埢囊阴；贵w

對于賴氨酸的乙?；揎?，Kim及其同事用免疫親和純化技術(shù)富集賴氨酸乙?；揎椀碾亩?，在Hela細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體中發(fā)現(xiàn)了195種賴氨酸乙酰化修飾蛋白。但是，賴氨酸乙?；贵w只能特異性識別賴氨酸殘基發(fā)生修飾的蛋白質(zhì)或肽段，不能檢測到絲氨酸和蘇氨酸的乙酰化修飾。用特異性識別絲氨酸或蘇氨酸乙?；揎椀目贵w將大大有利于絲氨酸和蘇氨酸乙酰化修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

2.2.3 以標(biāo)記底物為基礎(chǔ)的方法

Yu及其同事在酶GNAT的作用下，用氯代乙?；疌oA與其作用底物L(fēng)12反應(yīng)，導(dǎo)致氯代乙?；疞12的生成。然后將氯代乙?；疞12與熒光素His18俘獲的肽段一起孵育，經(jīng)過氯消除后，純化后的標(biāo)記的底物通過熒光自顯影便可看到。

德育教育與知識教學(xué)是相輔相成的。學(xué)生只學(xué)到知識而沒有基本品德的建立，那么我們培養(yǎng)的僅僅是“書呆子”。學(xué)生學(xué)習(xí)成績不好，但是有良好的思想品德，我相信這樣的學(xué)生也是會得到社會的認(rèn)可的。因此，德育教育比知識教育更為重要，有良好的思想品德作基礎(chǔ)，我們的基礎(chǔ)教學(xué)可以更高效地開展。在實際工作中，有效開展德育工作可以從以下幾點入手。

2.3 糖基化的研究方法及關(guān)鍵技術(shù)

2.3.1 放射性標(biāo)記法

其過程分為以下幾步進行:首先，是對所需的糖進行特殊標(biāo)記;其次，把處理好的糖加入培育好的細(xì)胞或組織中［12］;最后，就利用放射性自顯影技術(shù)對其進行鑒定。

2.3.2 分子熒光標(biāo)記法

鑒定糖基化蛋白最為普遍和最具效率的技術(shù)當(dāng)屬熒光分子標(biāo)記法，其基本原理是因為一部分的糖蛋白擁有自發(fā)光特點，所以能直接采用所檢測的熒光值說明蛋白進行糖基化修飾的程度，熒光值是利用熒光分光計來測量的。

2.3.3 電泳法

最古老對糖蛋白進行鑒定的技術(shù)便指電泳法，其包含單、雙向電泳兩種，這兩種技術(shù)能夠鑒定出糖蛋白。日常使用親和電泳比色法和SDS-PAGE法對糖基化程度的高低及糖基化中是否發(fā)生血紅蛋白的隔離進行鑒定［13］。

2.3.4 凝集素標(biāo)記法

2.3.5 抗體標(biāo)記法

抗體標(biāo)記法是針對糖蛋白所帶糖鏈的類型制備各種抗體，對糖蛋白進行檢測。

2.3.6 化學(xué)酵素法

生物學(xué)家Khidekel是最早研究此類技術(shù)的，他很早便發(fā)現(xiàn)了一種叫半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的物質(zhì)，這種物質(zhì)的功能非常強大，能使糖蛋白自動地攜帶含酮基的蛋白毒素抗體。

2.4 磷酸化的研究方法及關(guān)鍵技術(shù)

如今，在對磷酸化肽和磷酸化蛋白質(zhì)的探究中，對它們之間富集、分離及檢測所采用的技術(shù)非常之多，在此主要介紹四類辦法［14］:

2.4.1 免疫沉淀法

此技術(shù)的作用機制是要制備出一種特殊的抗體，它能對所有含磷酸化殘基的蛋白進行免疫沉淀，從而能高效地鑒定磷酸化蛋白。

2.4.2 流式細(xì)胞儀

實驗證明，流式細(xì)胞儀不僅可以測試轉(zhuǎn)錄活化基因STAT的活躍性和檢測信號傳導(dǎo)的作用，還能利用它檢測熒光強度，來分析酪氨酸磷酸化蛋白的濃度大小。

2.4.3 雙向凝膠電泳法

現(xiàn)今國際上一般是利用2D凝膠電泳對磷酸化蛋白進行鑒定的，此項技術(shù)已經(jīng)在得到科學(xué)家的廣泛認(rèn)可，及得到普遍的應(yīng)用。

2.4.4 固相金屬親和色譜

研究發(fā)現(xiàn)，這種方法最開始是被應(yīng)用在磷蛋白進行親和純化的過程中，固相金屬和磷蛋白中的磷酸殘基之間具有不錯吸引力，從而使得這些離子能夠被固定在糖蛋白上，最后利用IMAC柱就可以聚集那些進行磷基化的蛋白質(zhì)，從而對磷蛋白進行了鑒定。

2.5 酯基化的研究方法及關(guān)鍵技術(shù)

就當(dāng)今研究結(jié)果而言，所了解到的蛋白酯基化僅有四類:十四酰化、十六酰化、異戊烯化法呢基化、香葉基香葉基化。

生物學(xué)家Kho使用了tagging-via-substrate方法［15］，其首先對異戊烯化法呢基團進行加氮處理，并把它添加到已經(jīng)培養(yǎng)好的小鼠細(xì)胞溶液中，利用小鼠細(xì)胞進行新陳代謝這一生物功能，把含氮的法呢基團與酯基化作用的靶點相結(jié)合。由于異戊烯化法呢基團上的氮基團能夠和被生物素所標(biāo)記的三芳基膦脂這種物質(zhì)進行作用，所以最后可以采用對標(biāo)記物進行鑒定的方法來檢驗脂蛋白是否產(chǎn)生。

2.6 泛素化與SUMO化修飾的研究方法

一般先利用6xHis這種物質(zhì)對泛素蛋白進行標(biāo)記處理，再利用螯合親與色譜技術(shù)來聚集來檢測泛素化蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)泛素蛋白的碳尾部為Arg-Gly-Gly的構(gòu)造［16］，若用胰蛋白酶對它作用并發(fā)生降解反應(yīng)時，Gly-Gly這個基因片段仍仍能夠被保留在泛素蛋白的肽鏈結(jié)構(gòu)上，導(dǎo)致肽鏈基團的基因片段劇增一百多段，后面再利用串聯(lián)質(zhì)譜法來檢測泛素化的作用靶點。

綜上所述，目前所具有的對泛素蛋白探究的技術(shù)是非常少的，所具有的類型也很單調(diào)。對泛素蛋白的檢測、泛素作用靶點的定位以及泛素蛋白本身性質(zhì)的探究方法中，這些技術(shù)還必須進行不斷的改進和完善。除了泛素化修飾之外，還發(fā)現(xiàn)名為類泛素化修飾，類泛素化修飾(SUMO)是泛素化修飾的又一作用類型，它們之間具有顯著的序列同源性，在多數(shù)條件下，它們都能夠利用類似的作用機制來促使蛋白共價修飾的形成?，F(xiàn)今科學(xué)界中，大量的和蛋白泛素化修飾雷同的探索技術(shù)也都利用到對類泛素化(Sumoylation)的探究發(fā)現(xiàn)中。

3 翻譯后修飾的研究展望

一方面，由于蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能不管是對人類還是對動物來說，都有著非常重要的意義，而翻譯后修飾是使蛋白質(zhì)發(fā)揮其重要生物學(xué)功能的基石，所以這也是為什么要對此方面問題的討論花費巨大的時間與精力，及研究如此深入。時至今日，在生物界中所發(fā)現(xiàn)的翻譯后修飾的種類不計其數(shù)，已經(jīng)記錄在冊的就超過了400多種，并且科學(xué)家們還在不斷地探索發(fā)現(xiàn)。翻譯后修飾存在時空特異性的特點，主要表現(xiàn)在:若生物的內(nèi)在狀態(tài)發(fā)生變化時，翻譯后修飾的種類也會有所改變，其修飾程度還會隨著環(huán)境的改變而變化，而且某些修飾還是轉(zhuǎn)瞬即逝的，因此，定量研究翻譯后修飾及為重要。另一方面，盡管大規(guī)模翻譯后修飾蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)轟轟烈烈的進行，我們采用現(xiàn)有的技術(shù)也可以鑒定一定數(shù)量的翻譯后修飾蛋白，但是針對整個翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)來講，這些已作的研究很可能只是滄海一粟。因此翻譯后修飾的種類、過程以及其生物學(xué)功能還有待于進一步的研究和發(fā)現(xiàn)。即便如此，相信隨著科學(xué)的發(fā)展，這類問題都將迎刃而解，相信在不久的將來，新的翻譯后修飾的作用將會被發(fā)現(xiàn)，定量技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用也會日趨完善，人們對翻譯后修飾蛋白質(zhì)的認(rèn)識將更為深刻，這也必將加深人們對蛋白質(zhì)生物功能多樣性的認(rèn)識和體內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)通路的理解。

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