果蠅GAL4/UAS系統(tǒng)在本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

馬沛勤，蘇仙絨，陳 莉

(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000)

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子遺傳學(xué)、發(fā)育遺傳學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)內(nèi)容編入本科遺傳學(xué)教科書中(如基因轉(zhuǎn)座子遺傳分析、基因表達(dá)調(diào)控、免疫遺傳分析、基因組學(xué)與后基因組學(xué)等)，教科書內(nèi)容發(fā)生了轉(zhuǎn)折性的改革。漸漸地，經(jīng)典遺傳學(xué)內(nèi)容部分在教科書中的比重不斷減少，如劉祖洞在1991年主編的《遺傳學(xué)》中，經(jīng)典的三大遺傳規(guī)律內(nèi)容約占38%，而戴灼華在2008年主編的《遺傳學(xué)》中，三大遺傳規(guī)律內(nèi)容約占21%。但是，配合遺傳學(xué)教學(xué)的本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，在地方性院校卻幾十年如一日，仍然停留在驗(yàn)證遺傳規(guī)律和染色體制片觀察等經(jīng)典遺傳學(xué)內(nèi)容上，反映現(xiàn)代遺傳學(xué)內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)并沒有或很少進(jìn)入本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的課堂。究其原因是多方面的，如實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)及實(shí)驗(yàn)安排等都是限制因素。本實(shí)驗(yàn)改革以2006年張文霞主編的《遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》為參考，嘗試將果蠅的GAL4-UAS系統(tǒng)引入遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)。在本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中引入分子遺傳學(xué)的理念。

1．GAL4/UAS系統(tǒng)

GAL4蛋白是酵母中的一類轉(zhuǎn)錄因子，它能夠與特定的上游激活序列(Upstream Active Sequences，UAS)結(jié)合，并驅(qū)動(dòng)UAS下游基因的表達(dá)。

1．1 GAL4/UAS系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)節(jié)

半乳糖是通過轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖后進(jìn)入糖解途徑而被酵母利用的。從半乳糖的運(yùn)輸?shù)?-磷酸葡萄糖的轉(zhuǎn)化，需要C A L Z(透性酶)、G A LI(激酶)、G A L7(轉(zhuǎn)移酶)、G A LI O(差向異構(gòu)酶)和G A L S(變位酶)等的參與。這些gal基因的轉(zhuǎn)錄是被緊密調(diào)控的。gal4基因編碼一種能結(jié)合上述基因上游DNA序列(UAS)并激活這些基因轉(zhuǎn)錄的GA L4蛋白，是一種轉(zhuǎn)錄因子。GAL4蛋白共有881個(gè)氨基酸，包括N端的DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域、GAL80結(jié)合域、核定位信號區(qū)幾個(gè)功能域。UAS是GAL4蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)UAS含有數(shù)目不同的結(jié)合單元，結(jié)合單元的一致序列為CGGA(GC)GACATCAGGCAGGC［1］。在 G A L4 存在下，UAS是能增加任何基因轉(zhuǎn)錄的模式元件，其相互作用與方向和距離無關(guān)，是一種增強(qiáng)子序列。

1．2 果蠅GAL4/UAS系統(tǒng)的構(gòu)建

黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)屬于昆蟲綱、雙翅目、果蠅科、果蠅屬，具有許多優(yōu)良的特性。①易于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，生活周期短，后代多;②每條染色體都有人工構(gòu)建的平衡染色體，抑制重組并便于基因的定位;③攜帶的容易識別的標(biāo)記基因是遺傳篩選必不可少的工具;④巨大唾液腺染色體可直接觀察染色體畸變;⑤雄性果蠅的染色體不會(huì)發(fā)生減數(shù)分裂重組;⑥豐富的遺傳工具和不同的突變體庫。這些特點(diǎn)使黑腹果蠅成為重要的遺傳學(xué)研究模式動(dòng)物。

果蠅的GAL4-UAS系統(tǒng)是果蠅遺傳學(xué)研究中常用的基因表達(dá)工具之一。1993年，Brand和Perrimon將酵母的GAL4/UAS序列引入到果蠅中，發(fā)明了雙向法，將GAL4作為驅(qū)動(dòng)者，在上游連接組織性特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子序列，UAS作為應(yīng)答者，在下游連接靶基因，通過顯微注射的方法將這兩部分分別整合在不同的轉(zhuǎn)基因果蠅中。含有UAS-靶基因的轉(zhuǎn)基因果蠅品系，因?yàn)闆]有驅(qū)動(dòng)者，靶基因不會(huì)在親本中表達(dá)，只有在與驅(qū)動(dòng)者GAL4品系雜交后的子一代中，靶基因才會(huì)表達(dá)。這樣在時(shí)間上可以控制靶基因的表達(dá)。基因表達(dá)的位置和組織取決于GAL4前面連接的組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子序列［2］。因此利用不同的、特異的GAL4轉(zhuǎn)基因果蠅可以控制靶基因在不同組織的表達(dá)。

構(gòu)建轉(zhuǎn)基因品系的載體是P因子的骨架。果蠅的P因子(P-element)是果蠅自身的一種轉(zhuǎn)座子，可以在其自身產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶的作用下，在果蠅的基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座。通過剔除P因子內(nèi)轉(zhuǎn)座酶基因，使其成為轉(zhuǎn)基因的載體［3］。PGAWB是基于P因子建立的可以表達(dá)GAL4蛋白的載體，包括gal4基因，hsp70終止子。通過在gal4基因上游插入特異的啟動(dòng)子，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以構(gòu)建一系列在不同時(shí)期、不同組織內(nèi)表達(dá) GAL4蛋白的果蠅品系。P UAST也是基于P因子的載體，可供插入靶基因。PUAST包含5個(gè)UAS重復(fù)片段，hsp70啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)，以及SV40小 t內(nèi)含子和 polyA序列［4］。UAS的下游可以連接不同性質(zhì)的基因序列，如連接靶基因的小干擾RNA(siRNA)序列，在GAL4的驅(qū)動(dòng)下可以達(dá)到基因下調(diào)的目的［5］;UAS下游連接綠色熒光蛋白(GFP)基因，可以達(dá)到標(biāo)記特異細(xì)胞的目的。GAL4/UAS系統(tǒng)已成為一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。

1．3 eyeless-GAL4和 UAS-Rasv12轉(zhuǎn)基因果蠅品系

1．3．1 eyeless-GAL4 轉(zhuǎn)基因果蠅品系

eyeless-GAL4是只在復(fù)眼內(nèi)特異表達(dá)GAL4蛋白的轉(zhuǎn)基因果蠅品系。

果蠅的eyeless(ey)基因是果蠅復(fù)眼發(fā)育所必須的基因，與人的Pax基因同源［6］(一個(gè)在進(jìn)化上相當(dāng)保守的基因家族，它們編碼的產(chǎn)物是一類極為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，存在于從果蠅到人類的各種生物體中，參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控，在胚胎發(fā)育過程中對細(xì)胞分化、更新、凋亡起重要的調(diào)控作用，影響器官和組織的形成)，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及眼睛的形態(tài)發(fā)生過程中起重要作用。果蠅eyeless基因突變會(huì)導(dǎo)致眼睛結(jié)構(gòu)上的缺陷或復(fù)眼完全消失。eyeless最早表達(dá)于胚胎時(shí)期的神經(jīng)系統(tǒng)，在幼蟲階段持續(xù)地影響復(fù)眼發(fā)育。若將eyeless基因異位表達(dá)在復(fù)眼以外的部位，如使用dpp-GAL4(dpp是特異表達(dá)在肢體的基因的啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)UAS-eyeless在果蠅的翅、足及觸角上表達(dá)eyeless基因后，可以觀察到長在翅、足或者觸角上的紅色復(fù)眼小眼面。說明eyeless基因的功能確實(shí)是與復(fù)眼的生長發(fā)育相關(guān)eyeless-GAL4表示GAL4蛋白只在復(fù)眼內(nèi)表達(dá)。

1．3．2 UAS-Rasv12轉(zhuǎn)基因果蠅品系

UAS-Rasv12轉(zhuǎn)基因果蠅品系是一種含有靶基因ras的UAS果蠅品系。ras基因是研究較為深入的一個(gè)原癌基因(oncogene)，最早在病毒中發(fā)現(xiàn)，后來在人類、果蠅、線蟲、及酵母等生物中也發(fā)現(xiàn)該基因的同源基因。ras基因的產(chǎn)物具有很強(qiáng)GTP結(jié)合作用和GTP酶活性，通過GTP和GDP的相互轉(zhuǎn)化可以有節(jié)制地調(diào)控細(xì)胞的生長、增值和分化等重要生理過程。作為原癌基因的ras基因被激活以后就變成有致癌活性的癌基因，與GTP解離減少，失去GTP與GDP有節(jié)制的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長，并阻止細(xì)胞的自我毀滅、凋亡［7］。

基因突變與基因大量表達(dá)都會(huì)激活ras基因。ras基因的任何突變都使正常的RAS蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚴筃IH/3T3細(xì)胞(NIH 3T3是由美國國立衛(wèi)生研究院(簡稱NIH)所建立的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系，其特點(diǎn)是每3天傳代一次，每次接種3×105cells/ml。該細(xì)胞系在實(shí)驗(yàn)室常用來做轉(zhuǎn)染及基因表達(dá)的研究。)轉(zhuǎn)化的蛋白，并在裸鼠中誘導(dǎo)腫瘤的形成。Rasv12為ras基因的一個(gè)突變體。在ras基因附近插入一個(gè)強(qiáng)起動(dòng)子(Promoter)或增強(qiáng)子(enhaner)或能被GAL4誘導(dǎo)的UAS，都能使ras基因表達(dá)增強(qiáng)。

2．GAL4/UAS果蠅系統(tǒng)在遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中的構(gòu)建與實(shí)踐

實(shí)驗(yàn)題目:GAL4/UAS系統(tǒng)誘導(dǎo)ras癌基因在果蠅復(fù)眼中異位表達(dá)

實(shí)驗(yàn)材料:黑腹果蠅野生型;黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系eyeless-GAL4，黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系UASRasv12。實(shí)驗(yàn)材料由北京大學(xué)張文霞副教授果蠅實(shí)驗(yàn)室提供。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解如何通過GAL4-UAS系統(tǒng)在模式動(dòng)物黑腹果蠅中實(shí)現(xiàn)靶基因的時(shí)空表達(dá)。認(rèn)識GAL4-UAS系統(tǒng)在研究果蠅遺傳發(fā)育中的重要性和優(yōu)越性;理解分子調(diào)控、靶基因表達(dá)與個(gè)體的遺傳和發(fā)育每個(gè)環(huán)節(jié)都是可以操作和控制的現(xiàn)代遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)理念。

實(shí)驗(yàn)原理:將eyeless-GAL4驅(qū)動(dòng)者轉(zhuǎn)基因果蠅品系與應(yīng)答者UAS-Rasv12轉(zhuǎn)基因果蠅品雜交，雜合子代體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子GAL蛋白與UAS序列結(jié)合，誘導(dǎo)下游ras基因在復(fù)眼原基細(xì)胞中表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)器具及試劑:同果蠅雜交實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)步驟:

①以eyeless-GAL4或者UAS-Rasv12轉(zhuǎn)基因果蠅品系為母本，另一品系為父本，挑處女果蠅和雄性果蠅各7～8只，放入新鮮培養(yǎng)基中(25℃)培養(yǎng)。

②一周后，移去親本，繼續(xù)培養(yǎng)。

③至子一代成蟲羽化(ras基因的過量表達(dá)會(huì)引起果蠅的生長延滯，因此生活周期較野生型果蠅長)，觀察子一代成蟲復(fù)眼與野生型成蟲復(fù)眼的差異［2］。

作業(yè):拍照F1果蠅復(fù)眼與野生型果蠅復(fù)眼的差異，說明差異的原因。

3．將GAL4/UAS果蠅系統(tǒng)引入本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢

GAL4/UAS系統(tǒng)誘導(dǎo)ras基因在果蠅復(fù)眼中異位表達(dá)實(shí)驗(yàn)要求與果蠅雜交實(shí)驗(yàn)同步進(jìn)行，不需要增加實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)和專門安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間，不需要增添任何的儀器設(shè)備與試劑，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備簡單、省時(shí)省工，學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作熟練、結(jié)果準(zhǔn)確。更重要的是:學(xué)生通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直接觀察，了解了GAL4-UAS系統(tǒng)的分子調(diào)控機(jī)制;理解了基因在的形態(tài)發(fā)生中的作用、基因的調(diào)控作用和表達(dá)方式;認(rèn)識了GAL4-UAS系統(tǒng)在研究果蠅遺傳發(fā)育中的重要性和優(yōu)越性;也認(rèn)識了功能基因組學(xué)研究和基因工程技術(shù)的作用;對分子遺傳學(xué)的認(rèn)識由一個(gè)抽象的東西變成一個(gè)具體的東西，由一個(gè)想象的東西變成一個(gè)現(xiàn)實(shí)的東西。

［1］劉巍峰，高東．釀酒酵母GAL基因的表達(dá)調(diào)控［J］．微生物學(xué)通報(bào)，1998(2)．

［2］張文霞，戴灼華．遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］．北京:高等教育出版社，2007．

［3］劉曉雋，袁小京等．用增強(qiáng)子陷阱技術(shù)構(gòu)造并篩選果蠅UAS/GAL4系統(tǒng)中GAL4新品系及腦基因表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫的開發(fā)［J］．生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2008(6)．

［4］李春峰，夏慶友，周澤揚(yáng)．GAL4/UAS系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］．生物技術(shù)，2006(1)．

［5］劉勇，張梅超，韋有恒，馬維駿GAL4/UAS系統(tǒng)在果蠅Tis11基因RNA干擾中的應(yīng)用［J］．生命科學(xué)研究，2012(3)．

［6］李莉，楊洋，薛磊．Pax基因家族在果蠅發(fā)育過程中的調(diào)控作用［J］．遺傳，2010(2)．

［7］吳越．利用GAL4/UAS系統(tǒng)篩選人類功能基因及Ras在果蠅眼中抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制［D］，復(fù)旦大學(xué)博士論文集，2006．