RP-HPLC法測定不同產(chǎn)地黃芩中5種黃酮苷元成分的含量

顏 梅，徐菲拉，徐 斌，何三民，梅新路（金華市中心醫(yī)院，浙江金華 321000）

RP-HPLC法測定不同產(chǎn)地黃芩中5種黃酮苷元成分的含量

顏 梅＊，徐菲拉，徐 斌，何三民，梅新路#（金華市中心醫(yī)院，浙江金華 321000）

目的：建立測定不同產(chǎn)地黃芩中5種黃酮苷元成分含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Extend-C18（150mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），檢測波長為276 nm，流速為1.0m l/m in，柱溫為35℃。結(jié)果：去甲漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A的進(jìn)樣量分別在0.018 0～0.108 0、0.378 0～2.268 0、0.094 5～0.567 0、0.022 5～0.135 0、0.035 4～0.212 4μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r分別為0.999 9、0.999 5、0.999 6、0.999 5、0.999 5）；精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD＜3%；加樣回收率分別為98.72%（RSD＝2.5%，n＝6）、101.80%（RSD＝2.0%，n＝6）、99.25%（RSD＝2.3%，n＝6）、98.71%（RSD＝1.5%，n＝6）、99.05%（RSD＝1.2%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于黃芩中黃酮苷元成分的含量測定。

黃芩；黃酮苷元；含量測定；反相高效液相色譜法

＊藥師。研究方向：中藥鑒定。E-mail：415656073@qq.com

#通信作者：藥師。研究方向：中藥分析。E-mail：mei222331@163. com

黃芩最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效，是臨床大宗使用的藥材[1]。有關(guān)黃芩的傳統(tǒng)研究多集中在黃芩苷類成分上[2-3]，而近年來有關(guān)黃芩中黃酮苷元類物質(zhì)藥理作用的研究有所增多：黃芩素有抗菌消炎、抗病毒、降低血清膽固醇等作用；漢黃芩素有抗氧化、抗腫瘤等生物活性；千層紙素A有抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等生物活性[4-8]。目前，有關(guān)黃芩中黃酮苷元的質(zhì)量控制報道較少，因此筆者基于黃芩中苷類成分的含量測定方法，建立了一種同時測定黃芩中5種黃酮苷元成分含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，為提高黃芩藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200系列HPLC儀（美國Agilent公司）；SK5200LH型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；AB204-N型精密分析天平（上海世義精密儀器有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司）；鼓風(fēng)干燥箱（上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）。

1.2 試劑

黃芩素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111595-200905）；白楊素、漢黃芩素、千層紙素A、去甲漢黃芩素對照品均為筆者自制（純度均＞98%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

黃芩藥材于2012年9月分別采自河北承德、陜西商洛、內(nèi)蒙古赤峰、山東膠南、安徽亳州、甘肅天水（栽培）、甘肅天水（野生），經(jīng)我院何三民主任中藥師鑒定，1～5號為《中國藥典》收載正品Scutellaria baicalensisGeorgi，6、7號為甘肅當(dāng)?shù)仄贩N。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentExtend-C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；柱溫：35℃；檢測波長：276 nm；流速：1.0m l/min。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradientelution procedure

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取去甲漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A對照品適量，加入甲醇制備成每1m l分別含6、126、31.5、7.5、11.8μg的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取黃芩粉末（過五號篩）5 g，置150m l帶塞錐形瓶中，加水酶解后取出，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，再加入95%乙醇至含醇量為50%，濾過，濾液置250m l量瓶中，分別用提取溶劑少量多次洗滌容器和殘渣，洗液并入量瓶中。精密量取0.2 m l，置25m l量瓶中，以甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn)

精密吸取對照品和供試品溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，記錄65min內(nèi)的色譜圖。結(jié)果顯示，供試品中5種黃酮苷元成分都實(shí)現(xiàn)了良好分離，表明該方法穩(wěn)定、可行。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；1.去甲漢黃芩素；2.黃芩素；3.漢黃芩素；4.白楊素；5.千層紙素-AFig 1 HPLC chromatogramsA.m ixed control；B.test samples；1.norepinephrine wogonin；2.baicalein；3.wogonin；4.chrysin；5.oroxylin-A

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合照品溶液3.0、6.0、9.0、12.0、15.0、18.0μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積積分值（y）為縱座標(biāo)，進(jìn)樣量（x，μg）為橫座標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得去甲漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A的回歸方程分別為y＝64.063x+0.673 3（r＝0.999 9，n＝6）、y＝37.731x－3.973 3（r＝0.999 5，n＝6）、y＝48.178x+0.133 3（r＝0.999 6，n＝6）、y＝59.949x+0.473 3（r＝0.999 5，n＝6）、y＝42.736x（r＝0.999 5，n＝6）。結(jié)果表明，上述5種成分的進(jìn)樣量依次在0.018 0～0.108 0、0.378 0～2.268 0、0.094 5～0.567 0、0.022 5～0.135 0、0.035 4～0.212 4μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，重復(fù)6次。結(jié)果顯示，去甲漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A的RSD分別為1.2%、2.7%、1.2%、1.4%、1.3%、1.7%（n均為6），表明儀器精密度良好，

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取黃芩粉末適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，去甲漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A的平均百分含量分別為1.92%、8.47%、2.13%、0.1%、0.73%，RSD分別為1.3%、1.0%、0.5%、1.0%、1.2%（n均為6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，按上述色譜條件分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，去甲漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A的RSD分別為1.6%、1.1%、2.5%、2.5%、2.3%（n均為6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取黃芩粉末適量，精密稱定，共6份，分別精密加入混合對照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，去甲漢黃芩素的平均加樣回收率為98.72%，RSD＝2.5%（n＝6）；黃芩素的平均加樣回收率為101.80%，RSD＝2.0%（n＝6）；漢黃芩素的平均加樣回收率為99.25%，RSD＝2.3%（n＝6）；白楊素的平均加樣回收率為98.71%，RSD＝1.5%（n＝6）；千層紙素A的平均加樣回收率為99.05%，RSD＝1.2%（n＝6），表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.10 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地的黃芩藥材粉末適量，精密稱定，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以峰面積計算樣品中5種黃酮苷元成分的含量，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地黃芩中5種黃酮苷元成分的含量測定結(jié)果（%，n＝3）Tab 2 Results of content determ ination of flavonoid aglycone in S.baicalensis from different sources（%，n＝3）

3 討論

本試驗(yàn)首次采用RP-HPLC法同時測定黃芩中5種黃酮苷元成分——去甲漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A的含量，并比較了7個產(chǎn)地黃芩藥材的有效成分含量差異，與文獻(xiàn)[9]相比，目標(biāo)成分多，方法準(zhǔn)確、簡便、快速，重復(fù)性和分離效果好，可用于黃芩藥材和其黃酮苷元的質(zhì)量控制。

黃芩作為我國臨床常用藥材，由于產(chǎn)地及生長期限不同，各有效成分含量具有較大差異[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，僅以含量最高的黃芩素作為指標(biāo)，不同產(chǎn)地藥材的質(zhì)量差異顯著，由高到低依次為河北承德、內(nèi)蒙古赤峰、山東膠南、陜西商洛、安徽亳州、甘肅天水（野生）、甘肅天水（栽培）；如將其他4種成分的含量同時作為評價指標(biāo)，河北承德藥材的質(zhì)量最好。提示僅以單一成分作為質(zhì)量控制的指標(biāo)存在一定的局限性，需建立多種有效成分的含量測定方法才更容易全面控制藥材質(zhì)量。

本試驗(yàn)結(jié)果還表明，栽培黃芩和野生黃芩中的5種黃酮苷元成分含量總體上無明顯差異，這可為黃芩藥材的規(guī)范化種植提供依據(jù)；不同種屬的黃芩中黃酮苷元成分含量差異較大，故臨床應(yīng)用應(yīng)嚴(yán)格控制藥材產(chǎn)地。

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Content Determ ination of 5 Kinds of Flavonoid Aglycone inScutellaria baicalensisfrom Different Sources by RP-HPLC

YAN Mei，XU Fei-la，XU Bin，HE San-m in，MEIXin-lu（Jinhua Central Hospital，Zhejiang Jinhua 321000，China）

OBJECTIVE：To establish themethod for the content determination of 5 kinds of flavonoid aglycone inScutellaria baicalensisfrom different sources.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent Extend-C18（150mm×4.6mm，5μm）column w ithmobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0m l/min.The detection wavelength was set at 276 nm，and column temperature was 35℃.RESULTS：The linear ranges of norepinephrine wogonin，baicalein，wogonin，chrysin and oroxylin-A were 0.018 0-0.108 0μg（r＝0.999 9），0.378 0-2.268 0 μg（r＝0.999 5），0.094 5-0.567 0μg（r＝0.999 6），0.022 5-0.135 0μg（r＝0.999 5）and 0.035 4-0.212 4μg（r＝0.999 5）.RSDs of precision，reproducibility and stability tests were all lower than 3%.The recovery rates were 98.72%for norepinephrine wogonin（RSD＝2.5%，n＝6），101.80%for baicalein（RSD＝2.0%，n＝6），99.25%for wogonin（RSD＝2.3%，n＝6），98.71%for chrysin（RSD＝1.5%，n＝6）and 99.05%for oroxylin-A（RSD＝1.2%，n＝6）.CONCULSIONS：Themethod is simple，rapid and accurate，and it is feasible for content determination of flavonoid aglycone inS.baicalensis.

Scutelaria baicalensis；Flavonoid aglycone；Content determination；RP-HPLC

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2014）19-1782-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.19.18

2013-12-18

2014-04-05）