植物多酚提取與檢測方法的研究進(jìn)展

初 樂 趙 巖 和法濤 馬寅斐 朱風(fēng)濤 呂緒強(qiáng)

（中華全國供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南250014）

植物多酚（Plant Polyphenol）又名植物單寧（Vegetable Tannin），主要存在于植物的皮、根、葉、果中，在植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。常見的植物多酚有蘋果多酚、茶多酚、葡萄多酚、石榴多酚等。1796年，Seguin首次將植物水浸提物中可使生皮轉(zhuǎn)變?yōu)楦锏亩喾宇惢衔锓Q為“植物單寧”，多酚的研究工作就此開展。White和Bate-Smith定義植物單寧為相對分子量在500～3000范圍內(nèi)的具有鞣性的多元酚。而“植物多酚”術(shù)語是由Haslam[1]在1981年根據(jù)單寧的分子結(jié)構(gòu)及分子量提出的，涵蓋了所有單寧以及與單寧的衍生物質(zhì)。由于植物多酚具有獨(dú)特的功能價(jià)值，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、制革和日用化工等相關(guān)領(lǐng)域。

多酚物質(zhì)為極性有機(jī)化合物，可溶于水及甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑，不溶于氯仿。在酸性介質(zhì)中一般穩(wěn)定，但在堿性介質(zhì)中容易氧化褐變。目前國內(nèi)常采用有機(jī)溶劑法提取植物多酚，近年來，隨著新技術(shù)的研究，對多酚提取方法的研究也越來越多，本文簡要介紹了植物多酚的結(jié)構(gòu)和功效，并分析了植物多酚常用的提取方法以及定量檢測方法。

1 植物多酚的結(jié)構(gòu)和功效

植物多酚的科學(xué)分類法是在1920年由K.Freud enberg提出的，按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，可將植物多酚分為水解單寧（hydrolysable tannins）和縮合單寧（condensed tannins）。水解單寧（hydrolysable tannins）是單寧水解出來的產(chǎn)物，主要是一種酸酯類多酚；縮合單寧（condensed tannins）則主要由聚黃烷醇類多酚或原花色素，即羥基黃烷醇類單體的組合物，單體間以C-C鍵相連[2]。

由于多酚結(jié)構(gòu)的特殊性，酚羥基數(shù)目較多而且以鄰位酚羥基最為典型。這些鄰位酚羥基活性較強(qiáng)，極易被氧化，且對活性氧等多種人體自由基具有較強(qiáng)的捕捉能力，賦予了植物多酚最重要的功能：極強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的能力。因此，植物多酚被稱作人類健康的“第7營養(yǎng)素”。有專家提出，人類的疾病，如衰老、心腦血管疾病、癌癥等多是由于遭受過剩的自由基攻擊而引起的，通過服用植物多酚，清除過多自由基就能減緩疾病的發(fā)生。有研究者發(fā)現(xiàn)，葡萄酒在帶皮發(fā)酵過程會生成大量白藜蘆醇[3]，這是一種非黃酮類的多酚化合物，能夠抑制膽固醇和血脂的上升。在日本綠茶消費(fèi)較多的地區(qū)，胃癌發(fā)病率較低，這主要是因?yàn)榫G茶中富含茶多酚，長期飲用，可以減少癌癥和腫瘤[4]。可見，服用植物多酚，能夠有效減緩疾病的發(fā)生。

2 多酚的提取方法

多酚的提取方法較多，目前常用的主要有以下幾種。

2.1 有機(jī)溶劑萃取法

溶劑提取方法是我國最早使用的一種方法，使用最為廣泛。

多酚物質(zhì)一般極性較強(qiáng)，因此易溶于水。水雖然是植物多酚的良好溶劑，但并非適合于所有多酚物質(zhì)的提取。因?yàn)槎喾釉谥参矬w內(nèi)通常與蛋白質(zhì)、多糖以氫鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定的分子復(fù)合物，而多酚物質(zhì)大多分子量大、羥基數(shù)量多，所以在多酚提取時(shí)要求提取溶劑不僅對多酚具有良好的溶解性，而且能夠斷裂氫鍵，這樣才能最大程度地將植物中的多酚溶出。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，有機(jī)溶劑和水的復(fù)合體系最適合多酚物質(zhì)的提取，有機(jī)溶劑含量一般為50～70%[5-7]。由于有機(jī)溶劑的極性差異，對多酚的提取一般為：四氫呋喃＞丙酮＞甲醇＞乙醇＞丙醇，其中是丙酮-水是應(yīng)用最多的體系。

對于以縮合單寧為主體的植物，常采用弱酸性的醇-水體系，可提高多酚的提取率。但是，用這種溶劑提取的多酚是一個(gè)復(fù)雜的成分體系，包括單寧、低分子量的酚、黃酮類化合物，甚至糖類和色素[8]。為獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果，目前最常用的手段是將樣品干燥后，采用不同極性的有機(jī)溶劑進(jìn)行分步萃取。但該法也存在一些缺點(diǎn)，如溶劑使用量大，成本高，耗時(shí)長，不適合工業(yè)化的大生產(chǎn)等。

2.2 超臨界萃?。⊿FE）結(jié)合傳統(tǒng)工藝法

超臨界流體萃取技術(shù)與一般的萃取分離技術(shù)相比，傳遞性能良好，滲透力較強(qiáng)，對有機(jī)物質(zhì)萃取率高，產(chǎn)品質(zhì)量好。王小梅等[9]運(yùn)用超臨界二氧化碳萃取方法對茶多酚進(jìn)行了提取試驗(yàn)，結(jié)果表明：用超臨界CO2萃取茶葉中的茶多酚在工藝上是完全可行的，該方法的適宜實(shí)驗(yàn)條件是：萃取壓力為20MPa，萃取溫度為50℃，分離壓力為5MPa，分離溫度為40℃，CO2流量為25L/h，萃取時(shí)間為5h，此條件下，茶多酚的萃取率達(dá)9.0%。

此法與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑法相比，多酚得率、純度高，提取物中多酚含量高達(dá)90%以上；產(chǎn)品安全性能好，溶劑殘留量為零；溶劑使用量減少，降低了對環(huán)境的污染，符合植物多酚工業(yè)化生產(chǎn)對溶劑、制作路線、生產(chǎn)過程的安全性、多酚品質(zhì)等多方面的要求。但是由于萃取過程中系統(tǒng)必須處于超臨界狀態(tài)下才能進(jìn)行有效地分離，因而對設(shè)備要求比較高。超臨界設(shè)備的高價(jià)格阻礙了該項(xiàng)技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用實(shí)施，故目前此技術(shù)離工業(yè)化還有一定的距離。

2.3 微波提取法

近年來，隨著微波技術(shù)的快速發(fā)展，微波提取以其高效、節(jié)能、省時(shí)、具有強(qiáng)的植物細(xì)胞壁破除能力等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取[10，11]。相比而言，微波浸提比溶劑回流提取法選擇性高，比水蒸汽蒸餾法提取率高，這些都說明微波浸提技術(shù)與傳統(tǒng)提取方法相比有一定的先進(jìn)性。周謹(jǐn)?shù)萚12]利用微波技術(shù)提取銀杏黃酮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微波輻照5min基本可以達(dá)到常規(guī)加熱1h的效果，對黃酮物質(zhì)幾乎無破壞。周志等[13]以水為介質(zhì)對綠茶進(jìn)行微波處理，發(fā)現(xiàn)茶多酚浸出率高達(dá)90%以上，與傳統(tǒng)水煮相比極大地提高了多酚的提取效率。

2.4 高壓液相萃取法

該萃取方法通過高溫和高壓的方法提取植物中的多酚物質(zhì)，而且采用逐漸加溫、加壓的方式，減少多酚物質(zhì)在高溫、高壓下的分解，保證多酚的完整性。主要操作工藝為：將樣品放置在無污染的鋼質(zhì)萃取容器里，加入合適的萃取溶劑，封閉容器后，逐漸提升溫度（40～200℃）和壓力（3.5～21MPa），然后收集隨揮發(fā)氣體而溶出的多酚物質(zhì)。該方法提取率較高，而且耗時(shí)短，一般5～15min即可完成多酚物質(zhì)的萃取，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。Alonso-salces[14]認(rèn)為在植物活性成分的提取方面采用高壓液相萃取法即逐漸升溫、升壓比溶劑萃取法和超聲輔助提取法更為簡單高效。

3 植物多酚檢測方法

植物多酚的檢測方法主要有分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、高效液相色譜法等，比較常用的是分光光度法。

3.1 分光光度法

高錳酸鉀滴定法[15]在傳統(tǒng)的測定方法中具有一定的代表性，但由于高錳酸鉀具有強(qiáng)氧化性，造成方法的選擇性低、誤差大，逐漸被分光光度法所取代。分光光度法主要是利用多酚類化合物與特定的顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，反應(yīng)后溶液的吸光度與多酚含量成正比，進(jìn)而可以通過吸光度的大小判斷多酚的含量。

3.1.1 福林-肖卡法

福林-肖卡法[16]的主要原理是：在堿性溶液中多酚類化合物可以將鎢鉬酸還原（使W6+變?yōu)閃5+），生成藍(lán)色的化合物，顏色的深淺與酚類含量呈正相關(guān)，此化合物在760nm處有最大吸收峰。曹煒等[17]人采用福林—肖卡法測定蜂蜜中總酚酸的含量，但由于該法干擾因素多，偏差較大，微量分析的準(zhǔn)確度將難以保證。

3.1.2 酒石酸亞鐵法

1953年，Roux等人建立了多酚的酒石酸亞鐵測定法，主要原理是多酚能與酒石酸亞鐵形成藍(lán)紫色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在545nm下有最大吸收峰[18]。該法是多酚類化合物測定中引用最多的快速分析方法，也是我國國標(biāo)采用的方法。

鐘興剛等[19]比較了酒石酸亞鐵法和福林酚法測定茶多酚，發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)果相差30%左右，他提出，福林酚法更適合多酚含量比較單一的或是未氧化發(fā)酵的茶類中茶多酚的測定?？梢?，在方法的選擇上，原料和多酚性質(zhì)具有決定性的作用。

3.2 化學(xué)發(fā)光法

該法的原理是：物質(zhì)在化學(xué)反應(yīng)過程中吸收化學(xué)能而使分子激發(fā)出光，以此進(jìn)行測定。該法常用魯米諾作為化學(xué)發(fā)光試劑?；瘜W(xué)發(fā)光法的靈敏度高，線性范圍寬，儀器簡單，因此越來越受到科研人員的關(guān)注。米娟等[20]建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光（FI-CL）法測定茶葉中茶多酚的新方法，并該方法用于紅茶、綠茶等茶多酚含量的測定，加標(biāo)回收率為95.4～108.3%，與國家標(biāo)準(zhǔn)測定方法對比，結(jié)果較好。張亞莉等[21]建立了靜態(tài)注射化學(xué)發(fā)光法Luminol-H2O2-NaOH對中草藥黃芩中黃芩苷含量的檢測，可滿足分析的要求。

3.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法是目前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛、最有效的分離分析技術(shù)之一，該法分辨率高、分析速度快、重復(fù)性好、定量分析精確度高，因此發(fā)展迅速[22]。曲文娟等[23]建立了石榴皮水提取物中沒食子酸、安石榴甙A、安石榴甙B和鞣花酸4種多酚化合物的高效液相色譜（HPLC）分析方法，該方法回收率為83～112%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均低于10%，17min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)石榴皮水提取物中4種多酚化合物的快速檢測。劉建利等[24]建立了測定山楂中綠原酸、表兒茶素和蘆丁的反相高效液相色譜方法，采用的流動(dòng)相是由甲醇—乙腈（23:77，V/V）和0.1%甲酸組成，檢測波長為280nm，柱溫為30℃。本測定方法的回收率在91.8～110.9%之間，平均回收率為101.5%，說明該方法準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)語

如何提高植物多酚的提取率并最大程度地保留多酚的活性，是科研工作者在提取多酚時(shí)面臨的最大難題，因此許多先進(jìn)的提取技術(shù)不斷應(yīng)運(yùn)而生。但是，新技術(shù)大多僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，真正的實(shí)施應(yīng)用還處于起步，許多技術(shù)條件還不成熟，還不適宜大規(guī)模應(yīng)用。對于植物多酚的提取技術(shù)還應(yīng)繼續(xù)深入，使其盡快實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。

總之，在提取植物多酚時(shí)，應(yīng)選擇適宜的提取方法，同時(shí)，也可結(jié)合幾種方法進(jìn)行互補(bǔ)。既要勇于大膽嘗試新技術(shù)、新工藝、新設(shè)備，又要注意盡可能地降低生產(chǎn)投資成本。

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