抗氧化肽及其抗氧化活性評價方法研究

徐兆剛 董周永 周亞軍 徐艷陽

（吉林大學，吉林長春130012）

自Harman提出自由基理論以來，機體氧化產(chǎn)生的自由基與衰老和疾病之間的關系逐漸引起了學者們的注意。很多研究表明，癌癥、動脈粥樣硬化、關節(jié)炎、老年癡呆癥等疾病都與自由基有關[1]。Salim等[2]研究發(fā)現(xiàn)，機體過氧化能夠導致高血壓和2型糖尿病。雖然抗氧化劑已在食品工業(yè)中廣泛應用，但大部分都屬于人工合成的，這些抗氧化劑存在很多安全隱患[3]?？寡趸木哂泻軓姷目寡趸钚?，且無毒或低毒，目前已成為世界各國學者們爭相研究的熱點，而且部分抗氧化肽已經(jīng)得到初步的應用。本文簡要的介紹了抗氧化肽的來源，重點闡述了抗氧化肽抗氧化活性的體外評價方法，分析了實現(xiàn)體外評價方法統(tǒng)一化的可行性，以期為實現(xiàn)抗氧化肽評價標準的統(tǒng)一，提高各研究之間的可比性提供參考。

1 抗氧化肽的主要來源

抗氧化肽的來源可以分為三類：天然抗氧化肽、人工合成抗氧化肽以及蛋白降解產(chǎn)生的抗氧化肽。天然抗氧化肽也叫內源性抗氧化肽，主要是指生物體內天然存在的一類具有抗氧化活性的肽類物質，這類多肽具有清除氧自由基、抑制脂質過氧化的作用。目前能夠明確其分子結構并進一步研究其抗氧化機理的天然抗氧化肽主要有肌肽和谷胱甘肽等[4]。

人工合成抗氧化肽是指利用化學合成、酶法合成以及生物工程技術等途徑制成的抗氧化肽。此類抗氧化肽的合成具有定向性，利用固相、液相合成法或合成酶的催化作用等，以氨基酸、小肽等為原料，定向合成目標抗氧化肽。

利用蛋白降解產(chǎn)生抗氧化肽是抗氧化研究領域的一個熱點，它是利用動植物蛋白降解產(chǎn)生抗氧化肽，其方法主要有：酸堿水解法、酶水解法以及發(fā)酵法。目前采用發(fā)酵法來生產(chǎn)抗氧化肽的研究較少，酸堿水解法也已逐漸被淘汰，而酶解法因其條件比較溫和，副產(chǎn)物少，安全性高且產(chǎn)物活性好等原因應用較多，相對比較成熟。

2 抗氧化活性的評價方法及混合肽各組分間的相互作用關系

2.1 抗氧化活性的評價方法

2.1.1 常用方法

目前，已經(jīng)建立的評價物質抗氧化活性的方法有很多，研究者們可以利用這些方法便捷地評價抗氧化物質本身的以及經(jīng)過消化吸收后在細胞內的抗氧化能力[5]?，F(xiàn)行的體外抗氧化力的評價方法主要有：清除自由基的能力、抑制脂質過氧化的能力、還原力的測定以及螯合金屬離子的能力。

目前國內外運用較多的測定自由基清除能力的方法是：氧自由基吸收量（ORAC）的測定、ABTS法、DPPH法、羥自由基法，超氧陰離子自由基法等。ABTS和DPPH體系產(chǎn)生的自由基較穩(wěn)定，但因其自由基在生物體內并非自然存在，為使實驗結果更具準確性，現(xiàn)在越來越多的使用ORAC法。

檢測抑制脂質過氧化能力的方法主要有：硫代巴比妥酸（TBAS）法、亞油酸自氧化法（又稱硫氰酸鐵法）、電子自旋共振法。其中硫代巴比妥酸法較常用，其主要原理是利用TBAS與脂質過氧化反應的最終產(chǎn)物丙二醛（MDA）作用生成粉紅色物質，在532～535nm處有最大吸收，通過測定MDA含量，在一定程度上反映脂質過氧化的程度。

還原力的測定，通常被用來評價天然抗氧化物的提供氫原子或者提供電子的能力，具有較高還原力的物質通常具有較好的供電子能力[6]，因此，物質的還原力通常被看作是評價其抗氧化活力的重要指標。目前檢測還原力的方法主要有對亞鐵還原力（FRAP）的測定和對鉬還原力的測定。

螯合金屬離子能力的檢測方法目前主要有螯合鐵離子法和螯合銅離子法等。在正常機體內，亞鐵離子可以催化氧離子轉化為毒性更強的氫氧根離子，當有螯合劑存在時，亞鐵離子被螯合，減緩了這一過程。Kim等[7]研究胃腸消化蛋白產(chǎn)生的抗氧化肽時指出其抗氧化活性與螯合金屬離子有關。因此，評價抗氧化物的螯合能力可以間接地評價其抗氧化性能。此外，還有一些常用方法，如結晶紫法、亞硝基R鹽鈷離子褪色法、2-脫氧-D-核糖法、鄰苯三酚（焦性沒食子酸）的自氧化法等。

上述體外評價方法均屬于化學方法，而生物體內氧化過程極其復雜，因而導致在采用上述方法評價時，顯示較好抗氧化效果的肽未必在生物體內能取得良好的抗氧化效果。因此，在化學方法評價的基礎上需進一步結合生物試驗進行評價，常用的方法主要有：抑制肝臟線粒體脂質過氧化檢測法、抑制雙氧水誘導的紅細胞溶血能力實驗、抑制蛋白質羰基生成法、質粒DNA氧化損傷實驗等。如嚴群芳[8]利用動物體外試驗研究大豆抗氧化肽的抗氧化性，結果表明大豆抗氧化肽能顯著減少紅細胞自氧化溶血的發(fā)生，對小鼠肝組織勻漿自發(fā)性及亞鐵離子或過氧化氫誘導產(chǎn)生的丙二醛有一定的抑制作用，同時還能極顯著降低小鼠肝線粒體中脂質過氧化產(chǎn)物的含量，抑制肝線粒體的腫脹。Nazeer等[9]通過小鼠動物試驗發(fā)現(xiàn)，石首魚水解產(chǎn)物能夠提高細胞內源性抗氧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽轉移酶、超氧化物歧化酶的活性。

2.1.2 體外評價方法之間的關系

目前研究者們在評價某種活性肽的抗氧化力時，通常使用多種方法在不同的條件下進行分析，如Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，酶解水稻胚乳蛋白得到的抗氧化肽可抑制脂質的自氧化，同時還含有明顯的DPPH超氧化物及羥自由基清除能力。雖然目前抗氧化肽活性評價方法較多，但這些方法之間存在什么關系，如何選擇，尚未有定論，這使得各實驗間缺乏可比性，急需統(tǒng)一的抗氧化能力評價標準。趙濤[11]對用凝膠過濾色譜分離葵花籽粕蛋白酶解物所得3個組分的抗氧化性進行測定，結果發(fā)現(xiàn)，羥自由基：F2>F3>F1；ABTS 自由基：F2>F3>F1；DPPH 自由基：F2>F3>F1?？梢钥闯鲞@3種測定方法之間可能存在一定的正相關性。You等[12]研究表明蛋清蛋白抗氧化肽（水溶性的低分子量小肽）可以與水溶性的ABTS自由基充分反應，而較難與溶解于有機溶劑中的DPPH自由基反應。由此可以看出ABTS和DPPH法相關性可能較低。郭洋[13]在對高活性蛋清抗氧化肽組分進行活力評價時，采用了ABTS法、DPPH法、FRAP法和ORAC法，根據(jù)其測定結果，DPPH、FRAP以及ORAC結果大小順序一致，只是各組分間差異大小有所偏差，而ABTS與其他三種結果截然相反。劉洪對[14]對五種花生抗氧化肽體外抗氧化活性進行了比較，其結果為，對DPPH自由基清除活性的大小順序為：PP2＞AP＞FP＞PP1＞NP；還原力大小為：PP2＞AP＞ FP＞PP1＞NP；對鐵離子螯合能力大小為：AP＞FP＞PP1＞PP2＞NP；抑制脂質過氧化能力活性能力大小為：PP2＞PP1＞AP＞FP＞NP?？梢钥闯鯠PPH法和還原力法較接近，呈一定的正相關性。有學者[15]將亞油酸模擬氧化法對ABTS法、DPPH法、亞鐵離子螯合能力以及還原能力的測定做線性回歸分析，得到亞油酸模擬氧化法對這四種方法的相關性值，結果表明：亞油酸-ABTS為0.3861；亞油酸-DPPH為0.7508；亞油酸-螯合亞鐵離子為0.7583；亞油酸-還原力為0.4938。由此可以看出，亞油酸氧化法與螯合亞鐵離子的相關性最高，而與ABTS的相關性最低。顧龍建[16]對合成三肽的疏水性指數(shù)、化學抗氧化活性、細胞抗氧化活性（CAA）之間做相關性分析，結果表明疏水性指數(shù)與DPPH自由基清除能力及還原力呈顯著負相關，合成三肽的CAA值與DPPH自由基清除活性及還原力呈顯著正相關，基于相同反應機制的抗氧化活性測定方法間呈顯著正相關。張明[17]以4種常見的抗氧化劑為試驗樣品，利用不同的抗氧化檢測方法對其抗氧化效果進行評估，并對評估結果進行相關性分析，結果顯示各檢測法之間相關性較高的可以歸納為三組：結晶紫法、2-脫氧-D-核糖法、TBA法；肝臟線粒體脂質過氧化檢測分別與結晶紫法、TBA法、抑制蛋白質羰基化檢測、雙氧水誘導紅細胞溶血法有很好相關性；清除DPPH自由基法、亞硝基R鹽鈷離子褪色法、鄰苯三酚自氧化法也有很好相關性。這些方法在抗氧化肽的抗氧化能力檢測中是否仍具有這樣的相關性還有待于進一步研究。

綜上所述，抗氧化肽的抗氧化評價方法之間的確存在著相關性，有些方法之間相關性比較顯著，可以通過相關性的大小對評價方法進行分類，從不同類別的評價方法中篩選出具有代表性的方法組成一套通用的評價體系。這樣可以對活性肽的抗氧化能力進行全面的評價，各評價方法之間的相關性、分類及其同類別作用機理還有待于進一步的探究。

2.2 混合肽組分間的影響

一直以來，抗氧化肽與其他化學抗氧化劑之間的增效作用被廣泛研究，而蛋白降解產(chǎn)生的抗氧化肽是以一種肽的混合物狀態(tài)出現(xiàn)的，不同抗氧化肽組分之間是否有影響近些年也引起了研究者們的注意。李艷伏[18]的研究結果表明，核桃粕蛋白酶解物經(jīng)過分離純化后并沒有因為純度提高而顯著的提高抗氧化活性，甚至有的還降低了，而且提純前對O2-·清除率比對·OH清除率高，而提純后則相反。這也說明了不同肽之間可能存在相互作用，從而影響其抗氧化性。有學者[15]對一組混合肽的相互作用對總抗氧化能力的影響做了研究，結果表明，自由基清除能力較強的肽與清除能力較弱的肽在特定的情況下有微弱的協(xié)同增效的作用（ABTS清除能力），清除自由基能力較強的肽之間在ABTS自由基清除能力評價中幾乎都表現(xiàn)出加和或者拮抗作用，沒有協(xié)同增效作用；而在鐵離子還原能力測試中，其協(xié)同增效作用，均受主抗氧化劑（其中抗氧化活性較強的物質）濃度的影響，一定條件下產(chǎn)生增效作用；在ABTS體系中有相互作用的混合肽在亞油酸體系中卻沒表現(xiàn)出增效作用。Saito等[19]研究化學合成的三肽，發(fā)現(xiàn)這些三肽之間在亞油酸體系中沒有協(xié)同增效作用。

綜上可知，抗氧化肽之間在還原力測試方面在一定條件下可以產(chǎn)生增效作用，而在ABTS和亞油酸體系中效果不明顯。目前國內外對此相關的報道不多，但工業(yè)上使用的抗氧化肽多屬于混合肽類，因此，混合肽之間相互作用的關系及其作用機理也有待于進一步的研究開發(fā)。

3 抗氧化肽的應用及發(fā)展趨勢

目前國內對抗氧化肽的研究仍處于實驗室研究階段，只有少部分抗氧化肽得到實際應用，其研究開發(fā)領域主要集中在食品、醫(yī)藥、飼料以及化妝品等行業(yè)。

抗氧化肽在食品中的應用主要是利用其高抗氧化活性以及安全性，尤其是一些抗氧化肽的自由基淬滅能力，對油脂的抗氧化能力，對金屬離子的螯合能力不弱于人工抗氧化劑BHA等[20]，從而可以替代傳統(tǒng)的抗氧化劑，并且肽類物質，能夠被人體所需被吸收，營養(yǎng)價值更豐富?？寡趸某俗鳛榭寡趸瘎┦褂猛猓€可以作為功能因子等用于功能性食品的開發(fā)。如游麗君[21]通過研究泥鰍蛋白抗氧化肽，發(fā)現(xiàn)泥鰍多肽能夠起到抗疲勞的功效，表明可以將其應用到運動型功能飲料中；吳夏花[22]以核桃仁為原料，經(jīng)實驗研究分離出抗氧化活性較好的抗氧化肽并對其進行富集和冷凍干燥制成營養(yǎng)性核桃多肽粉?？寡趸脑谑称分械膽貌艅倓偲鸩?，仍需要大量的試驗和廣泛的探索，但前景十分廣闊。

在醫(yī)藥方面，雖然已有研究表明一些抗氧化肽對某些與機體氧化相關的疾病具有一定的預防和治療作用，但目前大都處于實驗階段，尚未進行臨床研究，只有極少數(shù)如谷胱甘肽、肌肽等被臨床應用。如國云華等[23]將還原型谷胱甘肽應用于急性病毒性肝炎的治療中，治療效果明顯，能有效地改善患者肝功能，減輕患者在用藥期間不良的反應。

目前國內外抗氧化肽發(fā)展都很迅速，但在抗氧化肽的制備上存在一些問題，如對適宜蛋白酶的選擇，控制酶解等關鍵技術以及活性肽脫苦等問題尚待解決。通過研究比較各評價方法之間的關系，篩選出一套通用的方法是可行的，這將增加各研究之間的可比性，便于抗氧化肽功能的研究，對于實際研究具有重要的意義。目前抗氧化肽與其他非肽類抗氧化劑增效作用研究較多，但混合肽之間的作用關系研究較少，抗氧化肽功能的開發(fā)研究，必將成為一個重要的課題。

[1]Sarmadi B H，Ismail A.Antioxidative peptides from food proteins：Areview[J].Peptides，2010,31:1949-1956.

[2]Salim S，Asghar M，Chugh G，et al.Oxidative stress：A potential recipe for anxiety，hypertension and insulin resistance[J].Brain Research,2010,1359:178-185.

[3]秦天蒼,于新華,葛寧,等.天然抗氧化劑在食用油中應用價值探討[J].糧食流通技術,2009,5:34-36.

[4]王瑞雪,孫洋,錢方.抗氧化肽及其研究進展[J].食品科技，2011,36(05):83-86.

[5]Serrano J，Goni I，Saura-Calixto F.Food antioxidant capacity determined by chemical methods may underestimate the physiologicalantioxidantcapacity[J].FoodResearch International,2007,40(1):15-21.

[6] Thana P，Machmudah S，Goto M, et al. Response surfacemethodologyto supercriticalcarbondioxideextractionofastaxanthinfromHaematococcus pluvialis[J]. Bioresource Technology, 2007, 99(06): 3110-3115.

[7] Kim S Y, Je J Y, Kim S K. Purification and characterization ofantioxidant peptide from hoki (Johnius belengerii) frame protein bygastrointestinal digestion[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry,2007, 18: 31-38.

[8]嚴群芳.大豆抗氧化肽的分離及其生物活性研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學,2006.

[9]Nazeer R A，Sampath Kumar N S，JaiGanesh R.In vitro and in vivo studies on the antioxidant activity of fish peptide isolated from the croaker(Otolithes ruber)muscle protein hydrolysate[J].Peptides,2012,35:261-268.

[10] Zhang J，et al. Isolation and identification of antioxidativepeptide from rice endosperm protein enzymatic hydrolysatebyconsecutivechromatography and MALDI-TOF/TOF MS/MS [J]. FoodChemistry, 2010, 119: 226-234．

[11]趙濤.葵花籽粕中綠原酸和蛋白酶解肽的制備及生物活性研究[D].呼和浩特:內蒙古農(nóng)業(yè)大學,2013.

[12]You SJ，Udenigwe CC，et al.Multifunctional peptides from egg white lysozyme[J].Food Research International,2010,43:848-855.

[13]郭洋.高活性蛋清抗氧化肽組分優(yōu)選及其增效技術研究[D].長春：吉林大學,2012.

[14]劉洪對,于麗娜,高俊安,等.五種花生抗氧化肽體外抗氧化活性比較[J].核農(nóng)學報，2013,27(8)：1162-1167.

[15]胡曉赟.小肽抗氧化性及協(xié)同作用研究[D].無錫：江南大學,2012.

[16]顧龍建.基于谷胱甘肽設計的抗氧化肽活性研究[D].廣州：華南理工大學，2013.

[17]張明.幾種體外抗氧化檢測方法的評價研究[D].西安：陜西師范大學,2010.

[18]李艷伏.核桃粕多肽提取分離及功能特性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2008.

[19]Saito K，Jin DH，Ogawa T，et al.Antioxidative properties of tripeptide libraries prepared by the combinational chemistry[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(12)：3668-3674.

[20]CHEN J，HU XY.Review on the antioxidant properties of protein hydrolysates[J].JournalofChinese Insituteof Food Science and Technology，2011,11(9):111-119.

[21]游麗君.泥鰍蛋白抗氧化肽的分離純化及抗疲勞、抗癌功效研究[D].廣州:華南理工大學,2010.

[22]吳夏花.營養(yǎng)型核桃多肽粉的研制[D].太原:山西大學,2012.

[23]國云華，于景宏.還原型谷胱甘肽在急性病毒性肝炎中的治療效果和藥理分析[J].中國保健營養(yǎng),2013,02:623.