龍血素A和龍血素B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立

雷麗云，沈 洲，龍 蓉，陳 素，成 波，劉向明

（中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，湖北 武漢430074）

龍血竭又稱(chēng)國(guó)產(chǎn)血竭，是傳統(tǒng)名貴中藥，系百合科龍血樹(shù)屬劍葉龍血樹(shù) Dracaena cochinchinensis（Lour．）S．C．Chen的含脂木材經(jīng)提取得到的樹(shù)脂［1］，具有活血散瘀、定痛止血等藥理作用［1－2］。龍血素A（LA）和龍血素B （LB）為龍血竭的主要活性成分［3－4］，LA對(duì)腦缺血有一定的保護(hù)作用［5］，LB通過(guò)調(diào)制電壓門(mén)控性鈉通道和 TRPV1受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［6－7］，LA和LB有望成為新的藥物前體。

目前對(duì)LA和LB含量的檢測(cè)只有高效液相色譜法［8－9］，但昂貴的儀器設(shè)備以及對(duì)操作者的專(zhuān)業(yè)要求限制了其應(yīng)用。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（ELISA）具有高通量、易操作、低成本等特點(diǎn)，在藥物檢測(cè)中已有廣泛的應(yīng)用［10］，建立靈敏便捷的測(cè)定LA和LB的ELISA方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。鑒于此，作者建立了LA和LB間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法，并將其用于LA和LB的含量測(cè)定。

1 材料

1．1 動(dòng)物

6周齡雌性BALB／c小鼠（18～22g），許可證號(hào)SCXK（鄂）2008－0005，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1．2 藥品與試劑

LA標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)111660－200402）、血竭素高氯酸鹽（批號(hào)110811－201105），中國(guó)食品藥品檢定研究院；LB（純度＞98%）、劍葉LA（純度＞98%）、劍葉LB（純度＞98%）、龍血竭、龍血竭總黃酮，廣西中醫(yī)藥研究院盧文杰教授提供并鑒定；雨林牌龍血竭膠囊（批號(hào)110403），西雙版納雨林制藥有限責(zé)任公司；云杉牌龍血竭膠囊（批號(hào)111032），云南云河藥業(yè)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、二甲基亞砜、辣椒素（capsaicin）、辣椒平（capsazepine），Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清蛋白（OVA），Biosharp公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，天津三箭生物技術(shù)有限公司；TMB雙組分顯色液A、B，鄭州博威嘉生物科技有限公司；96孔可拆酶標(biāo)板，Corning公司；總蛋白定量測(cè)試盒（BCA法），南京建成生物工程研究所；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．3 儀器

HH－CP－T型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；101－1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；DZF－0B6020型真空干燥箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；UV－3200PC型掃描型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；Thermo Labsystems Multiskan Ascent 354型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司。

2 方法與結(jié)果

2．1 半抗原的合成

采用溴乙酸法［11］給LA和LB加上游離羧基基團(tuán)合成半抗原，合成路線(xiàn)如圖1所示。

圖1 半抗原的合成路線(xiàn)Fig．1 Synthetic route of haptens

取LA和LB各60mg，分別溶于2mL干燥的二甲基亞砜中，各加入KOH粉末0．3g，攪拌5min后，加入溴乙酸60mg，繼續(xù)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h，加入冰水20mL，滴加2mol·L－1的HCl溶液酸化至溶液變?yōu)榘咨珳啙釥睿?℃過(guò)夜后，用G5砂芯漏斗過(guò)濾，沉淀物用冰蒸餾水洗滌，加丙酮收集沉淀，真空干燥得到半抗原：LA－4′－羧甲基醚（LA－4′－CME）和 LB－4′－羧甲基醚（LB－4′－CME）。

2．2 人工抗原的合成和鑒定

采用碳二亞胺法［12］將制備的半抗原與載體蛋白BSA偶聯(lián)合成完全抗原，即免疫抗原：LA－BSA和LBBSA。同法合成包被抗原：LA－OVA和LB－OVA。用總蛋白定量測(cè)試盒（BCA法）測(cè)定各人工抗原的濃度：LABSA為2．2mg·mL－1、LB－BSA為4．8mg·mL－1、LAOVA 為2．3mg·mL－1、LB－OVA 為2．4mg·mL－1。在190～300nm波長(zhǎng)間分別掃描LA、LB、載體蛋白和人工抗原的紫外吸收光譜，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 LA、LB、載體蛋白和人工抗原的紫外吸收光譜Fig．2 UV Spectra of LA，LB，carrier proteins and artificial antigens

由圖2可知，人工抗原的紫外吸收光譜與載體蛋白和對(duì)應(yīng)LA或LB的紫外吸收光譜明顯不同，且在波長(zhǎng)275nm附近人工抗原的吸收值顯著高于載體蛋白，可認(rèn)為半抗原與載體蛋白已發(fā)生偶聯(lián)。按文獻(xiàn)［13］方法，根據(jù)樣品濃度和紫外掃描的吸收值，估算各人工抗原的結(jié)合比：LA－BSA為41∶1、LA－OVA為15∶1、LB－BSA為76∶1、LB－OVA為17∶1。

2．3 動(dòng)物免疫

用免疫抗原LA－BSA和LB－BSA各免疫3只6周齡BALB／c雌鼠，免疫時(shí)取等量免疫抗原與弗氏完全佐劑（初免）或弗氏不完全佐劑（第2次和第3次免疫）混合，充分乳化后，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射，每只注射免疫抗原25μg。第3次免疫后第10d摘小鼠眼球取血，同時(shí)取沒(méi)有免疫的小鼠血作陰性對(duì)照。全血置37℃溫箱1h，再置4℃冰箱過(guò)夜后于3 000r·min－1離心15min分離出血清，分裝后于－20℃凍存。

2．4 間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)步驟

1）將包被抗原用0．05mol·L－1、pH 值為9．6的碳酸鹽緩沖溶液稀釋至一定濃度后包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，2～8℃過(guò)夜，洗滌液洗板3次后甩干。

2）每孔加封閉液（含1%脫脂奶粉的PBS）120 μL，37℃培養(yǎng)孵育2h，洗板3次后甩干，置30℃干燥箱中干燥3～4h，2～8℃密封存放，備用。

3）用PBST配制系列濃度的LA或LB標(biāo)準(zhǔn)品，包被酶標(biāo)板孔內(nèi)添加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品各50μL，各孔再添加一定稀釋度的抗血清溶液50μL，37℃孵育30min，洗板5次，甩干。

4）每孔添加稀釋5 000倍的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG溶液100μL，37℃孵育15min，洗板5次，甩干。

5）每孔依次添加顯色液A和B各50μL，避光反應(yīng)10min，再加入2mol·L－1硫酸50μL終止反應(yīng)。

6）用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm和630nm雙波長(zhǎng)OD值，以（OD450－OD630）作為反應(yīng)OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算得到樣品濃度。

2．5 抗血清效價(jià)的測(cè)定

包被抗原濃度為4μg·mL－1，將各動(dòng)物抗血清稀釋至不同濃度，檢測(cè)空白樣品OD值，以O(shè)D值在0．9～1．2之間的最大抗血清稀釋度作為此抗血清的效價(jià)。經(jīng)間接ELISA測(cè)試，抗LA血清效價(jià)最高達(dá)到8 000、抗LB血清效價(jià)最高達(dá)到30 000。

2．6 最佳包被濃度和抗血清稀釋倍數(shù)的確定

采用棋盤(pán)滴定法。包被抗原濃度：1μg·mL－1、2 μg·mL－1、4μg·mL－1、8μg·mL－1，抗血清稀釋倍數(shù)：500、1 000、1 500、2 000、4 000，測(cè)定 PBST 空白樣品和0．5μg·mL－1樣品的OD值，結(jié)果見(jiàn)表1。

選擇空白樣品OD值在1．0～1．4之間，且抑制率［抑制率＝（OD空白－OD樣品）／OD空白×100%］最大的包被抗原濃度和抗血清稀釋倍數(shù)組合作為最適條件。由表1可得LA最適工作條件為：包被抗原濃度8μg·mL－1、抗血清稀釋1 000倍；LB最適工作條件為：包被抗原濃度4μg·mL－1、抗血清稀釋1 500倍。

表1 LA和LB的棋盤(pán)滴定結(jié)果Tab．1 The result of checkerboard titration of LA and LB

2．7 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

LA和LB標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng·mL－1）：0、10、20、40、80、160、320、640。在最佳包被濃度和最佳抗血清稀釋倍數(shù)下進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、B／B0為縱坐標(biāo)（B為反應(yīng)OD 值，B0為0ng·mL－1標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)OD 值），用 GraphPad Prism5軟件擬合四參數(shù)Logistic方程得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖3），LA和LB標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)R2均大于0．99。經(jīng)10次檢測(cè)得到LA的IC50為（92．2±15．1）ng·mL－1，LB的IC50為（258．7±22．5）ng·mL－1。

圖3 LA和LB的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig．3 The ELISA standard curves of LA and LB

2．8 最低檢測(cè)限測(cè)定

重復(fù)檢測(cè)10次0ng·mL－1LA和LB標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合計(jì)算測(cè)得的濃度，以其均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差（x＋2sd）作為最低檢測(cè)限。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LA的最低檢測(cè)限為3．9ng·mL－1，LB的最低檢測(cè)限為26．1ng·mL－1。

2．9 精密度評(píng)價(jià)

分3批次測(cè)定高、中、低濃度LA和LB樣品，每批次各設(shè)10個(gè)復(fù)孔，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 批內(nèi)精密度和批間精密度Tab．2 The intra and inter assay precisions

由表2可以看出：LA檢測(cè)方法批內(nèi)精密度CV≤10．7%、批間精密度CV≤11．5%；LB檢測(cè)方法批內(nèi)精密度CV≤9．9%、批間精密度CV≤12．3%。

2．10 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)

分別測(cè)定2．9中的高、中、低濃度LA和LB樣品，每個(gè)樣品設(shè)10個(gè)復(fù)孔，計(jì)算回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LA回收質(zhì)量濃度均值分別為9．2ng·mL－1、110．8 ng·mL－1、244．7ng·mL－1，回收率分別為92．0%、110．8%、87．4%；LB回收質(zhì)量濃度均值分別為44．6 ng·mL－1、131．7ng·mL－1、317．8ng·mL－1，回收率分別為111．5%、109．8%、113．5%。

2．11 交叉反應(yīng)率檢測(cè)

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)LA和LB的6種結(jié)構(gòu)或功能類(lèi)似物的IC50，計(jì)算類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率，如表3所示。

表3 交叉反應(yīng)率／%Tab．3 The cross reactivity／%

由表3可以看出，LA與類(lèi)似物、LB與類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率最大分別為9．20%、3．64%，均不超過(guò)10%，表明檢測(cè)特異性較好。

2．12 藥物中LA和LB含量測(cè)定（表4）

由表4可以看出：LA和LB在4種龍血竭藥物中的最大含量與最小含量分別相差4．05倍和3．57倍；龍血竭總黃酮和膠囊B中2種成分含量均達(dá)到龍血竭藥物的2倍以上，說(shuō)明龍血竭總黃酮進(jìn)一步濃縮了龍血竭的藥效成分；而膠囊A中LB含量雖然超過(guò)膠囊B，但其LA含量在4種藥物中最低。

表4 藥物中LA和LB的含量測(cè)定Tab．4 Determination of the contents of LA and LB in the drugs

4種藥物中LB含量均達(dá)到國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定（≥0．40%）［14］。用 GraphPad Prism5軟件進(jìn)行2種成分含量相關(guān)性分析得到相關(guān)系數(shù)R為0．12、P＞0．05，說(shuō)明LA和LB含量不具有顯著相關(guān)性，這可能是由于不同廠(chǎng)家采用的生產(chǎn)工藝或提取方法不同造成的。為更有效地控制龍血竭藥物質(zhì)量，可以在藥品標(biāo)準(zhǔn)中增加對(duì)LA含量測(cè)定的要求。

3 結(jié)論

利用溴乙酸在強(qiáng)堿催化下與酚羥基發(fā)生親核取代反應(yīng)生成羧甲基醚作為半抗原，再用碳二亞胺法使其與載體蛋白偶聯(lián)合成人工抗原。建立的LA和LB的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法具有較高的精密度、準(zhǔn)確度和特異性，提供了檢測(cè)LA和LB的便捷有效方法。

［1］GUPTA D，BLEAKLEY B，GUPTA P K．Dragon′s blood：Botany，chemistry and therapeutic uses［J］．Journal of Ethnopharmacology，2008，115（3）：361－380．

［2］何書(shū)平．血竭的藥理研究［J］．中國(guó)藥房，2008，19（24）：1912－1914．

［3］陳素，劉向明，郭敏．龍血竭抑制大鼠脊髓背角廣動(dòng)力范圍神經(jīng)元誘發(fā)放電的藥效物質(zhì)［J］．中國(guó)科學(xué)：C輯，2008，38（12）：1130－1142．

［4］劉芳，戴榮繼，鄧玉林，等．龍血竭化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］．中國(guó)藥房，2010，21（15）：1437－1439．

［5］楊波，郭建恩，韓俊婷，等．龍血素A對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注引起的腦損傷及機(jī)制探討［J］．中藥新藥與臨床藥理，2010，21（2）：103－107．

［6］LIU X M，CHEN S，ZHANG Y X，et al．Modulation of dragon′s blood on tetrodotoxin－resistant sodium currents in dorsal root ganglion neurons and identification of its material basis for efficacy［J］．Science in China Ser C Life Sciences，2006，49（3）：274－285．

［7］WEI L S，CHEN S，HUANG X J，et al．Material basis for inhibition of dragon′s blood on capsaicin－induced TRPV1receptor currents in rat dorsal root ganglion neurons［J］．European Journal of Pharmacology，2013，720（1－3）：275－284．

［8］李忠瓊，向東．HPLC測(cè)定龍血竭中龍血素A和龍血素B的含量［J］．華西藥學(xué)雜志，2005，20（4）：348－349．

［9］劉立權(quán)．HPLC法同時(shí)測(cè)定龍血竭片中龍血素A、龍血素B和白藜蘆醇的含量［J］．中國(guó)藥房，2013，24（36）：3442－3444．

［10］王碩，張鴻雁，王俊平．酶聯(lián)免疫吸附分析方法［M］．北京：科學(xué)出版社，2011：1－15．

［11］劉珒，雷紅濤，孫遠(yuǎn)明，等．雌二醇間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附方法的建立［J］．食品科學(xué)，2012，33（8）：146－150．

［12］甘金華，鄧薇，李進(jìn)平，等．強(qiáng)力霉素人工抗原的合成與抗體制備［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30（2）：316－320．

［13］汪曉莉．己烯雌酚人工抗原的制備和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立［D］．武漢：湖北大學(xué)，2009．

［14］WS3－082（Z－016）－99（Z），龍血竭［S］．