貓皰疹病毒Ⅰ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用

王 吉，衛(wèi) 禮，付 瑞，李曉波，王淑菁，鞏薇，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 國家實(shí)驗(yàn)動物微生物遺傳檢測中心，北京 100050)

貓皰疹病毒I型(feline herpesvirus 1，F(xiàn)HV-1)又叫貓鼻氣管炎病毒(feline rhinotracheitis virus),屬皰疹病毒科，是有囊膜的雙鏈DNA病毒。病毒直徑約為128 nm～168 nm，能在貓胚腎、肺以及睪丸細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)良好增值和傳代。該病毒能致發(fā)貓鼻氣管炎病，貓是本病唯一的自然宿主，病貓是主要傳染源，通過直接接觸傳播[1-2]。主要侵害仔貓，感染貓癥狀嚴(yán)重時(shí)，出現(xiàn)體溫升高，明顯的上呼吸道感染[1-4].貓鼻氣管炎發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率可達(dá)50%。病毒在病貓的鼻、咽喉、氣管和支氣管以及舌、結(jié)膜等的部位增殖。該病最早從美國發(fā)現(xiàn)，隨后在拿大、英國、荷蘭、瑞士、匈牙利、越南等地發(fā)現(xiàn)和流行，我國已多次發(fā)現(xiàn)可疑病例，并分離到病毒[3-6]。

貓作為實(shí)驗(yàn)動物在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，在某些試驗(yàn)中，如降壓實(shí)驗(yàn)、作為弱視動物模型及高眼壓動物模型等具有不可替代的作用[7-9]，目前在實(shí)驗(yàn)動物國家標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn)中，均沒有對實(shí)驗(yàn)用貓的檢測要求及相關(guān)規(guī)定[10]。

本實(shí)驗(yàn)旨在建立特異、敏感、快速、定量準(zhǔn)確的FHV-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，通過分子生物學(xué)手段，開展對貓攜帶FHV-1核酸的檢測。對今后開展實(shí)驗(yàn)用貓的檢測工作及實(shí)驗(yàn)貓標(biāo)準(zhǔn)化研究具有積極的促進(jìn)作用，同時(shí)通過對貓皰疹病毒攜帶情況的檢測，為貓質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒及樣品

貓皰疹病毒I型(FHV-1)、貓細(xì)小病毒 (又稱貓泛白細(xì)胞減少癥)(feline panleukopenia virus, FPV)：購自美國ATCC公司，編號分別為(VR-636、VR-652)；單純皰疹病毒I型(herpes simplex virus 1，HSV-1)、犬皰疹病毒(canine herpesvirus ,CHV)、豬偽狂犬病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)：由中國食品藥品檢定研究院 實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量檢測室提供；pGEM-T Easy-pol質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：委托寶生物工程(大連)有限公司合成；pGEM T Easy質(zhì)粒(Promega公司)：寶生物工程(大連)有限公司；33只貓的48份樣品(眼分泌物、鼻分泌物、眼和鼻分泌物)來源于國內(nèi)7個(gè)單位。

1.2 主要試劑

DNA快速提取試劑盒購自德國Qiagen公司；Taq HS酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)、10× PCR buffer、100 bp DNA marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；pGEM-T Easy-pol質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：委托寶生物工程(大連)有限公司合成；pGEM T Easy質(zhì)粒(Promega公司)：寶生物工程(大連)有限公司；10× Q-PCR MIX：美國ABI公司。PCR儀：美國Bio-Rad公司MyCycler；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀：美國Bio-Rad公司PwerPac Basic；凝膠成像分析儀：美國 Kodak公司 GL212Pro；熒光定量PCR儀：美國ABI公司7500 Fast Real-Time PCR System.。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)控品的制備

設(shè)計(jì)1對擴(kuò)增TK基因保守區(qū)域的引物：P-1F：ATACTGTCCGCATTTACATAGA；P-1R：CGGTTCTTGAGCGTCCC。擴(kuò)增片段長531 bp (66442～66972 nt)。該片段包含了探針及其引物所要擴(kuò)增和檢測的片段。將該產(chǎn)物純化后連接到pGEM-T Easy載體，并進(jìn)行克隆。陽性克隆通過測序進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)陽性克隆菌并提取質(zhì)粒，用核酸蛋白分析儀測定A260nm和A280nm，并計(jì)算提取的質(zhì)粒含量，質(zhì)粒置-20℃保存?zhèn)溆肹11,12]。

1.4 TaqMan探針及引物的設(shè)計(jì)

將不同株FHV-1病毒序列進(jìn)行比對，選擇TK基因(序列號：FJ478159)保守區(qū)域[6、11]，采用ABI PrimerExpress 3.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成TaqMan探針及引物。探針的熒光標(biāo)記選擇FAM(5’端)作為報(bào)告發(fā)光基團(tuán), NFQ(3’端)為淬滅基團(tuán)，探針和引物由美國ABI公司合成。序列如下(表1)：

表1 用于擴(kuò)增TK基因的引物與TaqMan探針序列

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過優(yōu)化在熒光定量PCR反應(yīng)體系中使用的探針、引物、10× Q-PCR MIX濃度，確定最佳反應(yīng)體系為10× Q-PCR MIX 10 μL，探針+引物1 μL， DNA 1 μL，補(bǔ)水至20 μL。確定最佳反應(yīng)條件為：50℃保持2 min；然后95℃預(yù)變性10 min；最后95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號檢測。在96孔板中按以下體系加樣，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)。

用含有目的片段的質(zhì)粒pGEM-T Easy-pol作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)公式copies/μL=(6.02 × 1023)×(ng/μL × 10-9)/(DNA length × 660)，算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。將其稀釋為109copies～100copies，作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[12,13]。

Query:測序結(jié)果；sbjct:FHV-1文獻(xiàn)序列

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測

設(shè)定FHV-1、FPV、HSV-1、CHV、PRV及CRFK陰性對照，檢測FHV-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的特異性；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法對105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL 3個(gè)不同濃度陽性標(biāo)準(zhǔn)品，分3個(gè)不同時(shí)間重復(fù)檢測3次，計(jì)算批間變異系數(shù)，評價(jià)本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法靈敏性檢測

取109～100copies標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品各做3個(gè)復(fù)孔。所能檢測的最小濃度梯度的循環(huán)閾值(CT)≥35,拷貝數(shù)(copies)≥10時(shí),此濃度為方法的檢測靈敏度。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，48份樣品分2次檢測，第1次檢測b1～b15，第2次檢測y1～y15、yb56、yb64、yb65、x16、x18、x19、x24、x28、x29、x38、x40、x41、x44、x46、x47、x56、x57、x63。每次設(shè)107～103copies標(biāo)準(zhǔn)品和CRFK細(xì)胞陰性對照。標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照及樣品均做3個(gè)重復(fù)。

判斷標(biāo)準(zhǔn)的制定：建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Slope在-3～-3.5之間、R2大于0.99、Eff%在90%-110%之間，實(shí)驗(yàn)成立可用于定量檢測。

樣品循環(huán)閾值(CT)≥35,同時(shí)拷貝數(shù)(copies)≥10,判定該樣品檢測結(jié)果為陽性；循環(huán)閾值(CT)≥35、拷貝數(shù)(copies)<10，或者循環(huán)閾值(CT) <35、拷貝數(shù)(copies)≥10，或者循環(huán)閾值(CT) <35、拷貝數(shù)(Copies)<10，此樣品超出檢測限，不能確定被檢樣品是陽性樣品，結(jié)果判為陰性[12,13]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)控品的制備

陽性克隆經(jīng)測序進(jìn)行鑒定，測序結(jié)果與GenBank中FHV-1標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列進(jìn)行比對，其同源性均為100%，見圖1。說明成功制備了陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，可作為熒光定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)對照品。

經(jīng)拷貝數(shù)計(jì)算公式copies/μL=(6.02 × 1023)×(ng/μL × 10-9)/(DNA length × 660)計(jì)算，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原濃度為2.55× 1011copies/μL。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對引物及探針濃度進(jìn)行優(yōu)化后，得到FHV-1擴(kuò)增曲線結(jié)果如圖2。FHV-1的循環(huán)閾值CT值為14.023，拷貝數(shù)為2.597×107copies/μL。

用含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，分別設(shè)為1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102copies/μL，作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增曲線如圖3。擴(kuò)增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍1個(gè)log(1×102～1×109拷貝)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)Slope為3.23(在-3～-3.5之間)，R2值為0.997(>0.99)說明相關(guān)性高，定量結(jié)果有效，擴(kuò)增效率Eff為103.418%(90%～110%之間)。標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣本三個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差(CTSD值)均小于0.232，說明定量結(jié)果精密度高，具有很好的重復(fù)性。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)遠(yuǎn)優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定范圍，可用于定量檢測。

圖2 FHV-1Q-PCR擴(kuò)增曲線

圖3 109～102 copies標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法特異性檢測：分別以FHV-1、FPV、HSV-1、CHV、PRV及CRFK細(xì)胞為模板進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示，可以看出以FPV、HSV-1、CHV、PRV為模板，擴(kuò)增曲線均為直線無擴(kuò)增，陰性對照CRFK細(xì)胞也為直線無擴(kuò)增，而以FHV-1為模板擴(kuò)增曲線明顯。說明建立的熒光定量PCR檢測方法具有良好的特異性。

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測結(jié)果：起始濃度分別為1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品的最終實(shí)測值的均值分別為0.991×103、1.060×104、1.005×105copies/μL，對應(yīng)CTSD值及CV值分別為見表2。3個(gè)濃度梯度3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)Ct值的變異系數(shù)(CV)均小于5%，表明方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

1：FHV-1；2-6： FPV、HSV-1、CHV、PRV、CRFK

圖5 109～100 copies標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線

表2熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

Tab.2The results of repeatability and stability test of the Q-PCR

標(biāo)準(zhǔn)品(copies/μL)standard(copies/μL)實(shí)驗(yàn)次數(shù)The number of experiment每次檢測CT均值Mean CT value of every time detection 3次檢測CT均值Mean CT value of three times detection標(biāo)準(zhǔn)差CTSD變異系數(shù)CV (%)Coefficient of variation (%)118.694105217.26418.0520.7264.0318.197122.354104221.72622.2910.5362.4322.793125.957103225.02125.8760.8173.2326.649

圖6 109～100 copies標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 熒光定量PCR檢測方法靈敏度檢測

如圖5、圖6可知，擴(kuò)增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍 (1×100～1×109copies/μL)，良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率Slope為-3.156、相關(guān)系數(shù)R2值為0.993(>0.99)，擴(kuò)增效率Eff%為107.052%(90%-110%之間)。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到1.0×101copies/μL時(shí)有明顯擴(kuò)增曲線，CT值為31.856，拷貝數(shù)為10.23 copies，仍在可信范圍之內(nèi)； 1.0×100copies/μL時(shí)有擴(kuò)增曲線，CT值為34.705，拷貝數(shù)為1.121 copies，已超出可信范圍。所以臨界稀釋度為1.0×101時(shí)，其對應(yīng)的拷貝數(shù)為10，因此最低檢測限度為10個(gè)拷貝/μL。說明建立的熒光定量PCR方法有很高的靈敏度。

圖7 1～15號貓鼻分泌物(b1～b15)擴(kuò)增曲線

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的應(yīng)用

將所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法用于33只貓的48份樣品檢測，得到擴(kuò)增曲線如圖3-7為b1～b15擴(kuò)增曲線；圖8為y1～y15擴(kuò)增曲線；圖9為yb56、yb64、yb65、x16、x18、x19、x24、x28、x29、x38、x40、x41、x44、x46、x47、x56、x57、x63擴(kuò)增曲線。2次檢測標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線分別為 圖10、圖11，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)Slope分別為3.19、3.27(均在-3～-3.5之間)，R2值分別為0.996、0.994(均>0.99)，擴(kuò)增效率Eff分別為105.127%、101.639(均在90%-110%之間)。

經(jīng)過熒光定量PCR檢測b3、b4、b5、b6、b7、b8、b11～b15，y4、y5、y6、y7、y11～y15，yb56、yb64、yb65、x16、x19、x24、x28、x38、x41、x47、x56、x57、x63的循環(huán)域值(Ct值均≥35)和拷貝數(shù)(copies均≥10)均在檢測限之內(nèi)，所以判定上述樣品為熒光定量檢測陽性。其他15份樣品或循環(huán)域值(CT)超出檢測限，或擴(kuò)增拷貝數(shù)小于檢測限，或同時(shí)在檢測限之外，所以均判為陰性(樣品檢測結(jié)果見表3)。48份樣品檢測結(jié)果陽性率為(33/48)68.75%，33只貓經(jīng)檢測FHV-1陽性率為(23/33)69.70%。

圖8 1～15號貓眼分泌物(y1～y15)擴(kuò)增曲線

圖9 3只貓眼鼻分泌物和15份血清擴(kuò)增曲線

圖10 第一次檢測的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

圖11 第二次檢測的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

3 討論

貓可較好的耐受麻醉和一般手術(shù)，手術(shù)時(shí)能保持正常血壓。在藥品的降壓物質(zhì)檢查中，貓作為中國藥典規(guī)定的實(shí)驗(yàn)動物[10，15]，越來越多的被用于形覺波剝奪性弱視、食管病等研究[16，17]。貓作為實(shí)驗(yàn)動物，雖然應(yīng)用越來越廣泛[18-20]，但國內(nèi)目前尚未見有開展貓的檢測。雖然早在1999年，蔣虹等[21]就建立過貓鼻氣管炎病毒血清學(xué)檢測方法，2011年前劉寶山、林穎、屈哲[22-24]先后建立了FHV-1 PCR檢測方法，但都沒有推廣開來，實(shí)驗(yàn)用貓到目前為止也沒有標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定。目前，實(shí)驗(yàn)用貓也多是從商販或收購型飼養(yǎng)場購買，其來源混雜，遺傳、年齡、微生物和寄生蟲等攜帶情況不清，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性差，結(jié)果隱存著未知因素的影響[15]。FHV-1是目前已知最重要的貓呼吸道疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均較高,嚴(yán)重危害貓的健康。目前國內(nèi)還沒有開展貓皰疹病毒等貓易感病毒臨床檢測的機(jī)構(gòu)，仍未見有開展實(shí)驗(yàn)用貓F(tuán)HV-1檢測的報(bào)道，國內(nèi)也沒有相關(guān)檢測試劑盒的出售。

近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR) 技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析、突變和多態(tài)性研究、病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應(yīng)用[12-14]。該方法提供了用于對FHV-1進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的引物和TaqMan探針，以實(shí)現(xiàn)貓F(tuán)HV-1核酸的定量檢測，提高檢測的特異性和準(zhǔn)確性。

表3 熒光定量PCR方法檢測48份樣品結(jié)果

實(shí)驗(yàn)所建立的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，擴(kuò)增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍8個(gè)log(102～109拷貝)定量范圍寬，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2值均為>0.99，說明相關(guān)性高定量結(jié)果準(zhǔn)確。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)(Slope均在-3～-3.5之間、R2均大于099、Eff%均在90%～110%之間)均在規(guī)定范圍之內(nèi)，優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)特異性檢測與貓細(xì)小病毒、單純皰疹病毒1型、犬皰疹病毒及豬偽狂犬病毒均無交叉反應(yīng)，證明方法特異性良好。經(jīng)靈敏度檢測，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到101時(shí)仍有擴(kuò)增曲線，最低可檢測到10拷貝/μL。對起始濃度分別為1×103、1×104、1×105拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)測定， CT值變異系數(shù)均小于5%。說明此方法具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性[12-14]。

用熒光定量PCR技術(shù)檢測FHV-1,目前在國內(nèi)尚未有報(bào)道。本研究對引物和探針的濃度及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了特異、敏感的FHV-1快速定量檢測方法。對貓的檢測結(jié)果顯示，該方法檢測的33只貓，陽性率為69.70%(23/33)，明顯高于本室建立的常規(guī)PCR(陽性率63.64(21/33))檢出率。但從檢測成本考慮，熒光定量PCR檢測成本稍高于常規(guī)PCR。實(shí)驗(yàn)建立的FHV-1熒光定量PCR方法為進(jìn)一步研究FHV-1在貓群中的流行情況及對貓的感染機(jī)制及其致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。為實(shí)驗(yàn)用貓的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了科學(xué)參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 殷震, 劉景華. 動物病毒學(xué)(第2版)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1997: 1048-1051.

[2] 田克恭. 實(shí)驗(yàn)動物病毒性疾病 [M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1992: 232-237.

[3] Henzel A, Brum MC, Lautert C, et al. Isolation and identification of feline calicivirus and feline herpesvirus in Southern Brazil [J]. Braz J Microbiol, 2012 ,43(2): 560-568.

[4] Nakamura K, Ikeda Y, Miyazawa T, et al. Comparison of prevalence of feline herpesvirus type 1, calicivirus and parvovirus infections in and leopard cats in Vietnam [J]. J Vet Med Sci, 1999, 61(12): 1313-1315.

[5] 黃明. 貓傳染性鼻氣管炎研究進(jìn)展 [J]. 山東畜牧獸醫(yī), 2013, 34(9): 80-82.

[6] 張碩, 李純玲, 汪葆月, 等. 貓皰疹病毒I型的分離與鑒定 [J].實(shí)驗(yàn)動物科學(xué), 2010, 27 (2):21-25.

[7] 劉繼峰, 谷昱, 白玉, 等. 虎皮貓用于MZR降壓物質(zhì)的檢查 [J]. 實(shí)驗(yàn)動物科學(xué), 2009, 26(2): 33-35.

[8] 化志鵑, 江春光. 左旋多巴對形覺剝奪性弱視幼貓圖形視覺誘發(fā)電位的影響 [J]. 昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 31(5): 12-16.

[9] 劉文舟, 羅向霞, 段俊國, 等. 家貓高眼壓模型的建立及特征分析 [J]. 國際眼科雜志, 2009, 9(10): 1881-1884.

[10] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(2010年版二部)[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010：附錄ⅪG: 103.

[11] Jack HN, Deann KW, Georgette EC ,et al. Identification of the thymidine kinase gene of feline herpesvirus: use of degenerate oligonucleotides in the polymerase chain reaction to isolate herpesvirus gene homologs [J]. J Virol. 1989, 63(8): 3240-3249.

[12] 張榮建. 猴腺病毒檢測方法的建立與初步應(yīng)用 [D]. 北京: 中國食品藥品檢定研究院, 2012.

[13] 栗景蕊. 猴泡沫病毒(SFV)檢測方法的建立與初步應(yīng)用 [D]. 北京: 中國食品藥品檢定研究院, 2010.

[14] 馮育芳, 李曉波, 邢進(jìn), 等. 猴副流感病毒5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立與初步應(yīng)用 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 23(10): 40-43.

[15] 劉繼峰, 劉軍須, 曾振山, 等. 虎皮貓?jiān)诮祲何镔|(zhì)檢查中的應(yīng)用 [J]. 醫(yī)學(xué)動物防制, 2012, 28(6): 597-599.

[16] 化志鵑、江春光. 左旋多巴對形覺剝奪性弱視幼貓圖形視覺誘發(fā)電位的影響 [J]. 昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 31(5): 12-16.

[17] 劉文舟, 羅向霞, 段俊國, 等. 家貓高眼壓模型的建立及特征分析 [J]. 國際眼科雜志, 2009, 9(10):1881-1884.

[18] 張曉艷, 謝鵬雁, 王化虹, 等. 電針?biāo)峁嘧⑹彻苎棕堊闳镅▽ο率彻芾s肌調(diào)節(jié)功能的研究 [J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2011, 20(20): 2490-2492.

[19] 羅勛, 王云, 王春花, 等. 貓下丘中央核52HT、P物質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞年齡相關(guān)變化 [J]. 中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志, 2011, 20(3): 207-211.

[20] 華田苗, 王振華, 徐金旺, 等. 對比度檢測學(xué)習(xí)提高貓的視覺對比敏感度 [J]. 動物學(xué)研究, 2010, 31(2): 155-162.

[21] 蔣虹, 時(shí)建東, 吳小閑. 貓病毒血清學(xué)檢測方法的建立及初步應(yīng)用 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)雜志, 1999, 9(1): 39-41.

[22] 劉寶山, 林穎, 尹榮煥, 等. 貓皰疹病毒1型PCR檢測方法的建立 [J]. 畜牧與獸醫(yī), 2010, 42(1): 74-76.

[23] 林穎, 劉寶山, 任會軍, 等. 貓傳染性鼻氣管炎PCR檢測方法的建立 [J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī), 2010. 8:71-73.

[24] 屈哲, 徐鑌蕊, 雎艷平, 等. 貓病毒性鼻氣管炎PCR檢測方法的建立與應(yīng)用 [J]. 中國獸醫(yī)雜志,2011, 47(5): 25-26.