實(shí)驗(yàn)性糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠模型的步態(tài)行為分析

孫宇楠，李二平，董世芬，秦靈靈，孫建寧

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 10012)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，發(fā)病率約占糖尿病患者的30%～50%，是糖尿病患者主要的致殘因素之一[1]。DPN患者多是60歲以上的老年人，常見步態(tài)異常、體態(tài)不穩(wěn)、搖擺，行走時(shí)出現(xiàn)跌倒、外傷[2]。DPN患者在病程早期會(huì)出現(xiàn)對(duì)稱性肢體麻木、襪套樣感覺、踩棉花感、蟻?zhàn)吒械萚3]，但是這些異常感覺在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上表現(xiàn)不明顯。目前對(duì)DPN動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)仍依賴神經(jīng)電生理檢查[4]，但其不適宜作為常規(guī)檢查，易受到肢體溫度的影響。所以有必要建立一種簡(jiǎn)便易行檢測(cè)動(dòng)物行為學(xué)的評(píng)價(jià)方法。

大小鼠實(shí)時(shí)步態(tài)分析系統(tǒng)是一個(gè)定量評(píng)價(jià)動(dòng)物步態(tài)的裝置，利用高速攝像頭(120幀/s)捕捉腳印信息，然后通過計(jì)算機(jī)處理各腳印的照片信息和相互關(guān)系[5]，研究大小鼠行走時(shí)所表現(xiàn)的姿態(tài)，得到步行周期、支撐時(shí)相、步速等90余種指標(biāo)，從而客觀、準(zhǔn)確和全面地反映出動(dòng)物步態(tài)的變化情況。本研究建立實(shí)驗(yàn)性糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠模型，檢測(cè)其實(shí)時(shí)步態(tài)行為變化，擬為DPN的基礎(chǔ)和臨床研究提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和環(huán)境條件：健康SD大鼠，體重(200～240)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供【SCKK(京)2012-0001】，在北京中醫(yī)藥大學(xué)無特定病原體(specific pathogen-free，SPF)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室【SYXK(京)2011-0024】飼養(yǎng)，每日光照12 h，房間溫度和濕度保持在(23±1)℃和65%±5%，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適用的“3R”原則給予人道關(guān)懷。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝取食水。

1.1.2 主要儀器：大小鼠步態(tài)分析處理系統(tǒng)，GAS-2，北京鑫海華儀科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：大鼠禁食15 h后，鏈脲佐菌素以0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液(pH4.4)配成1%的濃度，以45 mg/kg進(jìn)行腹腔注射。于72 h、1周和4周測(cè)定血糖值，選擇持續(xù)血糖水平≥16.7 mmol/L以上的大鼠為糖尿病周圍神經(jīng)病變組(DPN組，共13只，雄6只，雌7只)，健康大鼠作為正常對(duì)照組(共12只，雌雄各6只)。

1.2.2 步態(tài)分析：造模第12周，使用GAS-2對(duì)運(yùn)動(dòng)中的大鼠進(jìn)行步態(tài)分析。連續(xù)訓(xùn)練7 d，每天3次，直到所有的動(dòng)物在無刺激的條件下可以不停頓的在跑道上完成行走，進(jìn)行3次實(shí)時(shí)步態(tài)行為錄像[6]。大鼠腳掌與玻璃平板表面接觸時(shí)，光線向下反射，下方的高速攝像頭可以捕捉到清晰的腳印圖像，經(jīng)專用的分析軟件Gait Analysis Lab 6.0分析。相關(guān)指標(biāo)及定義見表1。

表1 步態(tài)指標(biāo)定義

2 結(jié)果與分析

2.1 步行周期檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的平均步行周期和四足步行周期均顯著延長(P<0.01)。結(jié)果見表2。

2.2 支撐時(shí)長檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的四足支撐時(shí)長均顯著延長(P<0.01)。結(jié)果見表3。

2.3 擺動(dòng)時(shí)長檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的四足擺動(dòng)時(shí)長均顯著延長(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表4。

2.4 支撐時(shí)相檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的四足支撐時(shí)相有不同程度的增加(P<0.01)。結(jié)果見表5。

2.5 擺動(dòng)時(shí)相檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的四足擺動(dòng)時(shí)相均顯著減少(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表6。

2.6 步幅檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，，DPN模型大鼠的步幅減小，右前足步幅差異有顯著性(P<0.01)。結(jié)果見表7。

2.7 速度檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的速度和四足瞬時(shí)速度均顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見表8。

表2 步行周期

表3 支撐時(shí)長

表4 擺動(dòng)時(shí)長

表5 支撐時(shí)相

表6 擺動(dòng)時(shí)相

表7 步幅

表8 速度

表9 足跡最大面積

表10 足跡平均面積

表11 足跡最大強(qiáng)度

表12 足跡平均強(qiáng)度

表13 體態(tài)

表14 協(xié)調(diào)性

2.8 足跡最大面積檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的四足足跡最大面積降低，左后足差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)果見表9。

2.9 足跡平均面積檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的四足足跡平均面積降低，但無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見表10。

2.10 足跡最大壓強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的四足足跡最大壓強(qiáng)降低，左前足和右前足有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果見表11。

2.11 足跡平均壓強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的四足足跡平均壓強(qiáng)有不同程度的增加(P<0.05或P<0.01)。.結(jié)果見表12。

2.12 體態(tài)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的體轉(zhuǎn)角標(biāo)準(zhǔn)偏差顯著增加(P<0.05)；絕對(duì)值平均體轉(zhuǎn)角和和絕對(duì)值體轉(zhuǎn)角標(biāo)準(zhǔn)偏差顯著增加(P<0.01)。結(jié)果見表13。

2.13 協(xié)調(diào)性指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

STZ注射12周，與正常組比較，DPN模型大鼠的左前相對(duì)與右前的同源協(xié)調(diào)性和右前相對(duì)于左前的同源協(xié)調(diào)性顯著降低(P<0.05)；右前相對(duì)于右后的同側(cè)協(xié)調(diào)性和右后相對(duì)于右前的同側(cè)協(xié)調(diào)性顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見表14。

3 討論

DPN通常會(huì)先引起患者感覺異常、減退、缺失，合并血管病變導(dǎo)致肌肉和關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)異常，足底壓力異常，從而導(dǎo)致足部潰瘍、壞疽，以至截肢。這通常是一個(gè)隱匿、漸進(jìn)的過程，其病理的嚴(yán)重性與癥狀的出現(xiàn)及其嚴(yán)重性往往不一致。早期發(fā)現(xiàn)DPN，及時(shí)干預(yù)治療，可避免不可逆晚期病變的發(fā)生[7]。臨床檢查主要通過一些評(píng)分方法對(duì)DPN癥狀進(jìn)行量化和評(píng)估，如密西根神經(jīng)病變篩查量表(Michigan Neuropathy Screening Instrument，MNSI)評(píng)分法[8]，多倫多臨床評(píng)分系統(tǒng)(Toronto Clinical Scoring System，TCSS)[9]，糖尿病神經(jīng)病變癥狀評(píng)分(Diabetic Neuropathy Symptom, DNS)評(píng)分法)[10]，這些方法受主觀因素的影響較大，并且無法應(yīng)用于四足動(dòng)物的評(píng)估。對(duì)于DPN的確切診斷還必須依靠一些客觀的神經(jīng)功能檢查，如神經(jīng)傳導(dǎo)功能檢查、定量感覺檢查、神經(jīng)活檢等[11]。

步態(tài)行為的變化是多因素共同作用于肌肉和關(guān)節(jié)的結(jié)果，DPN患者并發(fā)微血管病變和糖尿病足，會(huì)導(dǎo)致疼痛、針刺感、麻木、乏力、平衡障礙等感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變的發(fā)生[12]。臨床通過步態(tài)定量分析步速、步長、足底對(duì)地壓力等參數(shù)[13]，發(fā)現(xiàn)DPN患者在行走過程中與地面接觸的時(shí)間更長，接觸面積更大，力度與時(shí)間積分明顯延長，速度更慢，步幅更小[14]。

目前國內(nèi)外還未見有關(guān)糖尿病周圍神經(jīng)病變動(dòng)物步態(tài)研究的相關(guān)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中STZ注射12周時(shí)，DPN模型大鼠也出現(xiàn)了步態(tài)行為的改變，平均步行周期和四足步行周期顯著延長，支撐時(shí)長和擺動(dòng)時(shí)長延長，支撐時(shí)相增加，擺動(dòng)時(shí)相減少，足跡平均壓強(qiáng)增加，步幅減小，步行速度減小，絕對(duì)值平均體轉(zhuǎn)角增加，同源協(xié)調(diào)性和同側(cè)協(xié)調(diào)性降低。絕對(duì)值平均體轉(zhuǎn)角的增加和協(xié)調(diào)性指標(biāo)的降低說明DPN模型大鼠的軀體擺動(dòng)增加、平衡性下降。DPN模型大鼠足跡平均面積的變化與臨床患者表現(xiàn)不同，可能與DPN模型大鼠的爪子存在內(nèi)卷和外翻的畸形有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物來源于同一批次，正常組和模型組動(dòng)物均是隨機(jī)挑選產(chǎn)生，因此認(rèn)為步態(tài)數(shù)據(jù)基數(shù)處于同一水平，所以造模前未進(jìn)行步態(tài)數(shù)據(jù)的檢測(cè)。注射STZ后，大鼠逐漸出現(xiàn)糖尿病飲食水量增加，尿量增加，體重減輕。隨著糖尿病病程的發(fā)展，出現(xiàn)了行動(dòng)遲緩，步長變短，行走時(shí)軀體擺動(dòng)幅度加大，足底壓力增加。臨床患者在高血糖的影響下，神經(jīng)組織和微血管發(fā)生病變，外周神經(jīng)受到損傷，跖屈肌能力減弱，出現(xiàn)步長縮短和步速減慢；對(duì)身體中心轉(zhuǎn)移的適應(yīng)性降低，身體左右、前后擺動(dòng)增加[15]；隨著病情發(fā)展，足底壓力發(fā)生變化，區(qū)域壓力異常，進(jìn)而發(fā)生局部高壓，加大足潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)[16]。本實(shí)驗(yàn)中DPN大鼠的步態(tài)變化情況與臨床患者的癥狀吻合。

綜上所述，GAS-2步態(tài)分析系統(tǒng)能夠清晰明確地分析DPN模型大鼠的步態(tài)行為改變，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。希望通過對(duì)實(shí)時(shí)步態(tài)行為進(jìn)行更深入的研究，使之成為一種評(píng)價(jià)DPN模型的新方法。

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